Результаты реакции агглютинации

Вывод_ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________

Рис.1 Реакция кольцепреципитации (1-опыт; 2-контроль)

Рис.2 Реакция преципитации в агаре

§ 7. В основе методов иммуносорбентного анализа твердой фазы лежит сорбция антител (для обнаружения неизвестного антигена) или антигена (для обнаружения соответствующих антител) и специфических антител, меченных ферментом (ИФМ) или изотопом (РИМ). Чувствительность этих методов значительно превышает чувствительность обычных иммунологических реакций, поэтому они приобрели самое широкое рас­пространение. Практически эти методы могут быть использованы для диагностики любого инфекционного заболевания. С помощью этих методов можно определять как антигены, так и антитела к ним. Методика постановки этих реакций включает три последовательных этапа.

Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ.

Первый этап - адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связываются со стенками лунок, но у них сох­раняются свободными активные центры, и они способны поэтому специ­фически реагировать с соответствующим антигеном.

Второй этап - связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело-антиген, происходящей на границе твердая фаза - жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.

Третий этап - обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело - антиген специфическими антителами против дан­ного антигена, но меченными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в иссле­дуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фазы формируется комплекс: антитело-антиген - меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит ортофенилендиамин (ОФД) в смеси с Н₂0₂, используемый в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку раствора ОФД приводит к тому, что он подвергается действию персокидазы, фиксированной на антителах, образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой позволяет количественно оценивать результаты опыта фотометрированием.

Радиоиммуный метод (РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицатель­ных образцов.

Обнаружение специфических антител с помощью ИФМ и РИМ

Для обнаружения антител эти реакции также ставятся в три этапа.

Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т.е. на их стенках антигены уже адсорбированы.

Второй этап - добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в них специфических антител к данному анти­гену. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген-антитело.

Третий этап - после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые антитела (антивидовые, т.е. антитела про­тив человеческих иммуноглобулинов, но меченные ферментом (ИФМ) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оцениваются как указано выше. В качестве контролей используют образцы, заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Рис.3 Схема использования иммуноферментного и радиоиммунного метода для обнаружения антигенов (А) и антител (Б). Обозначения: 1.Поверхность твердой фазы; 2.Специфические антитела; 3.Антиген (исследуемый материал); 4.Специфические к данному антигену антитела, меченные Ферментом (5) или изотопом (6); 7.Субстрат фермента; 8.Специфический антиген; 9.Исследуемая сыворотка (антитела); 10.Антивидовая сыворотка, содержащая антитела к челове­ческому иммуноглобулину и меченная ферментом (11) или изотопом (12); 13.Субстрат для фермента.

§ 8. Моноклональные антитела - антитела, продуцируемые одним клоном антителообразующих клеток. По всем параметрам антитела, вырабатываемые одним клоном, идентичны (по классу иммуноглобулинов; по их типу и антительной специфичности). Они взаимодействуют только с одним антигеном, и это обстоятельство значительно повышает специфичность всех иммунологических реакций, в которых они участвуют. Получение моноклональных антител стало возможным после того, как в 1975 году Кёллером и Мильштейном была разработана методика получения клеточных гибридов -гибридом путем слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с культивируемыми в питательной среде клетками миеломных штаммов. Были использованы такие штаммы, которые не содержали фермента гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (поэтому они погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин - ГАТ).

Лимфоциты в такой среде не гибнут. Слияние лимфоцитов с миеломными клетками осуществляется с помощью полиэтиленгликоля. Слившиеся гибридомные клетки получают от лимфоцита способность синтезировать определенные антитела (моноклональные антитела, т.е. анти­тела одной специфичности) и способность выживания в среде с ГАТ. От миеломного партнера они получают способность размножаться бесконеч­но in vitro.

Накопившийся гибридомный клон может быть размножен, а синтези­руемые им моноклональные антитела могут быть получены в неограниченном количестве.

Уже созданы фирмы по выработке моноклональных антител любой специфичности в качестве уникальных реагентов, диагностических и лечебных препаратов.

Получение лимфоцитарных гибридом включает в себя несколько эта­пов:

1.Получение миеломкой линии.

2.Получение селезеночных клеток от иммунизированного организма.

3.Создание в культуре условий для того, чтобы хотя бы некоторые клетки одной и другой популяции могли осуществить слияние.

4.Выделение слившихся клеток и накопление их клонов.

5.Отбор заданного клона, его накопление и использование. Накопление клона осуществляется in vitro или путем введения животным.

При этом на всех этапах образующиеся клетки необходимо консер­вировать в жидком азоте, чтобы в любое время можно было вернуться к любому этапу и сохранить на будущее нужные клоны.

В качестве миеломных клеток чаще всего используются мышиные или крысиные клеточные линии. Гибридомы создают не только на основе В - лимфоцитов, обеспечивающих возникновение культур, синтезирующих моноклональные антитела, но и на основе Т - лимфоцитов. Уже сконструированы культуры Т - гибридом, синтезирующие лимфокины.

Контрольные вопросы

По каким признакам определяется степень агглютинации в пробирках?

Как производится оценка степени агглютинации?

Для чего необходим контроль в реакции агглютинации?

При какой степени агглютинации реакция считается еще положительной?

Какая агглютинация происходит раньше: 0- или Н-?

Как отличить осадок бактерий от их агглютинации?

В каких случаях происходит спонтанная агглютинация бактерий?

Что такое групповая агглютинация?

Что такое гаптен? Детерминантная группа? Шлеппер?

Какие компоненты участвуют в реакции преципитации?

Какова методика постановки реакции кольцепреципитации?

Для каких целей используется реакция преципитации в агаре?

Какова методика постановки реакции преципитации в агаре?

В чем заключается сущность реакции пассивной гемагглютинации?

Какие компоненты участвуют в реакции коагглютинации и как она ставится?

В чем заключается сущность реакции латекс-агглютинации?

Как ставится реакция агрегат-гемагглютинации и с какой целью она применяется?

На чем основаны методы иммуносорбентного анализа твердой фазы?

С какой целью используются иммуноферментные методы?

Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антитела в иссле­дуемой сыворотке?

Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антиген в иссле­дуемом материале?

Рис.4 Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) Эр-эритроцит; Аг-антиген; Ат-антитела к антигену; Эрс-сенсибилизированный эритроцит.

Как ставится реакция латекс-агглютинации и как она оценивается?

Что такое моноклональные антитела и каковы их преимущества перед обычными иммунными сыворотками?

Как получают моноклональные антитела?

Из каких основных этапов складывается постановка реакций иммуноферментного метода и радиоиммунного метода?

Что такое гибридомы и как их получают? Какие клетки скрещивают­ся для получения гибридом?

Какая разница между антигенным и антительным эритроцитарным диагноетикумом?

Поиск по сайту: