Бактериологическое исследование. Лабораторная диагностика холеры имеет исключительно большое значение, поскольку выделение возбудителя дает право установить окончательный диагноз и развернуть

Лабораторная диагностика холеры имеет исключительно большое значение, поскольку выделение возбудителя дает право установить окончательный диагноз и развернуть профилактические меры для прекращения эпидемического распространения заболевания. Кроме того, она позволяет выявить вибрионосиив, оценить контроль за объектами окружающей среды и эффективность дезинфекции. Бактериологическое диагностику проводят поэтапно. Первый этап. Изучаемых материалов изготавливают мазки, фиксируют спиртом или смесью Никифорова, окрашивают по Граму и микроскопируют под иммерсионным объективом. Холерные вибрионы выглядят немного согнутыми палочками красного цвета, расположенными между тяжами слизи в виде своеобразных скоплений, напоминающих "стайке рыбок". Наряду с типичными вибрионами в мазках время проявляют шаровидные, колбоподибни, спиралевидные клетки. Это уменьшает диагностическую ценность бактериоскопического метода. На этом этапе с целью ускорения исследования целесообразно использовать реакцию иммунофлюоресценции с мечеными диагностическими 01 холерными сыворотками и РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом. Используют и имуноиушовий метод: фиксированные мазки обрабатывают 2 мин во влажной камере тушью, смешанной с противохолерной сывороткой, промывают и микроскопируют. Холерные вибрионы окрашиваются в черный цвет. Для быстрого и надежного обнаружения холерных вибрионов в различных объектах окружающей среды, особенно тех, которые плохо или совсем не культивируются, используют метод полимеразной "цепной реакции. Одновременно с бактериоскопию проводят посев исследуемого материала в жидкие и на плотные питательные среды. Из жидких сред чаще используют 1% щелочную пептонную воду теллурита калия и среда Монсури, из плотных - щелочной МПА, селективные среды TCBS, Аронсона, Монсури. Посевы делают в 1% пептонную воду, щелочной МПА и на одно из селективных сред (лучше всего TCBS). При доставке материала в транспортной среде из него делают висел в 50 мл 1% лептонной воды рН 9.3 (среда обогащения). tV Среда Аронсона: МПА, к которому добавляют сахарозу и фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Среда Монсури: на 1 литр дистиллированной воды берут 15 г агар-агара, 1 г желатина, 10 г хлорида натрия, 50 г таурохолаиу натрия, ЗО г карбоната натрия. Среда TCBS (тиосульфат-цитрат-бромтимол сахарозный агар) имеет стандартный состав, выпускается в готовом сухом виде. На 1 л дистиллированной воды добавляют 69 г сухого порошка. Второй этап. Через 5-6 ч инкубации посевов в термостате производят мазок с поверхности жидкой среды, висящую каплю для определения подвижности и проводят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с 01 (или RO, 0139) диагностической сывороткой ("слайд-агглютинация"). Одновременно делают высев с 1% пептонной воды на щелочной МПА или другие селективные среды с целью получения изолированных колоний. При отсутствии видимого роста в первой лептонной воде производят высев из нее в другую пептонную воду (в случае первоначального посева в среду обогащения с рН 9,3 дальнейшее висел над ним проводят через 14-20 ч). Посевы в жидкие и на плотные среды проводят большой бактериологической петлей диаметром 5 мм. По результатам исследования выдают предварительный ответ об обнаружении холерного вибриона. Третий этап. Посев из второй среды обогащения производят на щелочной МПА (или один из элективных плотных сред) через 5-6 ч при рН 7,8 и через 14-20 ч при рН 9,3. Четвертый этап. Через 16-24 ч выращивания посевов на плотных элективных средах проводят макро-и микроскопическое исследование изолированных колоний и пересел на двовуглеводне среду Ресселя (лакгозно-сахарозный агар) или на тривуглеводне среду Клиглера (глюкозо-лактозо-сахарозный агар) с целью выделения чистой культуры и ее идентификации. Колонии холерных вибрионов на щелочной МПА в типичной S-форме имеют размеры 2-3 мм, круглые, гладкие, плоские, голубоватые, прозрачные, гомогенные, с ровными краями, маслянистой консистенции, легко снимаются петлей и емульгуються. При посеве материалов от больных, принимавших антибиотики, и виброносиив, могут вырастать атипичные колонии. На агаре Аронсона колонии холерных вибрионов имеют ярко-красный цвет, в среде TCBS они желтые на зеленом фоне, в среде Монсури колонии без цвета, полупрозрачные, с темным центром. С колониями на щелочной МПА ставят пробу на оксидазу, а с теми колониями, выросшие на элективных средах, эту пробу ставить нецелесообразно. При отборе колоний используют индикаторные бумажки (СИП-1 - набор для идентификации вибрионов). Оксидазопозитивни колонии проверяют в "слайд агглютинации" с холерной сывороткой 01 (R0, 0139) в разведении 1:100 и вариантоспецифичнимы сыворотками Инаба и Огава (1:50) готовят мазки для окраски по Граму и обрабатывают люминесцентной сывороткой. Положительные результаты дают право выдать предварительный ответ об обнаружении холерного вибриона. Пятый этап. Исследуют характер роста на поливуглеводних средах. Холерный вибрион на агаре Ресселя меняет цвет столбика при сохранении первоначального цвета скошенной части без образования газа. Среда Клиглера желтеет полностью без образования газа и сероводорода. Культуры проверяют по морфологическим и аглютинабельнимы свойствами, а в случае необходимости определяют группу по Хейберг. Ставят также развернутую объемную реакцию агглютинации в пробирках по общепринятой методике в соответствии с инструкцией к диагностической сыворотки. При отсутствии реактивов на оксидазу можно использовать пробу "тяжа". На предметное стекло наносят каплю 0,5% водного раствора дезоксихолат натрия или 2,5% раствора моющего средства "Прогресс", добавляют полную петлю агаровой культуры исследуемых вибрионов и тщательно перемешивают. При положительной реакции суспензия немедленно теряет мутность, становится слизистой и вязкой - тянется за петлей в виде тяжа, что характерно для вибрионов. В последнее время разработаны тесты для дифференциации классического варианта холерного вибриона от биовары эльтор. Чувствительность выделенных культур холерных вибрионов к антибиотикам и химиотерапевтических препаратов определяют с помощью метода диффузии в агар с использованием стандартных дисков или методом серийных разведений. Шестой этап. Окончательно учитывают результат идентификации чистых культур и выдают окончательный ответ о выделении холерного вибриона серогруппы: ОИ, RO (Инаба, Огава, Гикошима) или 0139. Если выделенные вибрионы по большинству признаков относятся к холерных, но аглютинуються сыворотками, выдают ответ о выделении холерных вибрионов не ОИ группы (так называемых НАГ-вибрионов). Обязательно отмечают гемолитическую активность, чувствительность к антибиотикам и лизис культуры соответствующим бактериофагом.

Поиск по сайту: