Бактериологическое исследование. Хламидий не растут на искусственных питательных средах

Хламидий не растут на искусственных питательных средах. Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким, является метод диагностики хламидийной инфекции посредством изоляции возбудителя на культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами (Золотой стандарт). Для этой цели обычно используют культуру клеток McCoy, обработанных циклогексамидином.

Используемые питательные среды:

-ростовая среда: среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин 5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 4% от общего объема, гентамицин 40 мкг/мл.

-изолирующая среда (среда с антибиотиками для заражения клеток клиническим материалом): среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин 5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 8% от общего объема, гентамицин 40 мкг/мл, 10% глюкоза 5 мл.

-транспортная среда (для забора и хранения клинического материала): фосфатный буфер с сахарозой.

Методика: готовят раствор циклогексимидина на изолирующей среде. В стерильные плоскодонные пробирки с помещенными в них покровными стеклами добавляют клеточную суспензию и ставят их на 16-24 часа в термостат при температуре 37°С. Во флаконы с транспортной средой, содержащей клинический материал, при интенсивном встряхивании добавляют свежеприготовленную изолирующую среду. В это время из пробирок с монослоем удаляют ростовую среду, не разрушая монослоя. Затем распределяют изолирующую среду из флаконов с инфекционным материалом в плоскодонные пробирки с монослоем и центрифугируют, затем инкубируют в термостате при 37°С в течение 2-х часов, удаляют изолирующую среду и добавляют новую порцию изолирующей среды с циклогексамидином. Материал инкубируют в термостате при 37°С 48-72 часа. После инкубации приготовленные препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе и определяют включения возбудителя ИФМ.

Выделение хламидий в культуре клеток позволяет выявить жизнеспособные хламидий и определить их чувствительность к антимикробным препаратам.

Исключить артефакты, возникающие при диагностике хламидиоза люминесцентными методами, позволяет дополнительный тест. Предложенный проф. В.В. Делекторским тест основан на том, что элементарное тельце хламидий представляет собой кристаллоид, что является следствием макромолекулярной упаковки ДНК. Перефокусировка люминесцентного микроскопа приводит к возникновению по периферии элементарного тельца четкого дифракционного кольца (кольцо Френеля).

Другие микроорганизмы, а также ретикулярное тельце хламидий, дифракционное кольцо не образуют. Достоверность метода не требует находки 10 элементарных телец в микроскопе. Диагноз считается положительным, если в препарате обнаруживается 2-3 элементарных тельца, образующих при фокусировке дифракционные кольца. Наличие дифракционного кольца у исследуемых структур является дополнительным диагностическим тестом, позволяющим исключить ошибки диагностики.

Следует особенно отметить, что при наличии смешанного процесса, в частности гонорейно-хламидийного, диагностика хламидиоза ИФМ затруднена. Это связано с тем, что при гонорее за счет большого количества лейкоцитов слизистые покрыты слоем белка, следствием чего является большое количество ложноотрицательных результатов. Инкубационный период при гонорейной и хламидийной инфекциях различен, поэтому при одновременном инфицировании этими двумя микроорганизмами, хламидии могут выявляться значительно позже.

Серологическое исследование используется как дополнительный метод для обоснования диагноза.