Серодиагностика сифилиса

Наиболее доступна и применяется как основной метод диагностики. Серологические методы диагностики применяются для подтверждения клинического диагноза сифилиса, выявления скрытого сифилиса, контроля за лечением, в качестве одного из критериев излеченности инфекции, а также для скрининга групп населения в целях профилактического осмотра.

В крови у больных сифилисом выявляются неспецифические (реагины) и специфические (трепонемные) антитела. Неспецифические антитела (реагины) направлены против липидных антигенов T.pallidum и против аутоантигенов липидной природы (кардиолипин, лецитин, холестерин), появляющихся вследствие деструкции клеток организма в процессе инфекции. Специфические антитела классов IgG и IgM направлены против протеиновых антигенов T.pallidum. Необходимо помнить, что первый период сифилиса является серонегативным и характеризуется отрицательными серологическими реакциями. Антитела в крови больных удаётся обнаружить не ранее, чем через 2-3 недели после появления твёрдого шанкра. Для серо- и ликвородиагностики сифилиса в России могут применяться следующие методы:

1. Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР), которая является отборочным тестом при обследовании населения на сифилис. Постановка МР осуществляется с плазмой или инактивированной сывороткой крови.

2.Иммуноферментный анализ (ИФА). С использованием антигена из культуральных или патогенных бледных трепонем.

3.Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), с использованием антигена из культуральных или патогенных бледных трепонем.

4.Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ-абс, РИФ-ц, РИФ с капиллярной кровью из пальца. Антиген - патогенная бледная трепонема штамма Никольса.

5.Комплекс классических серологических реакций на сифилис (КСР), состоящий из реакции связывания комплимента (реакция Вассермана) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами. Поскольку трепонемный антиген является специфическим, КСР являются диагностическими тестами.

6.Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), в которой в качестве антигена используют патогенные бледные трепонемы штамма Никольса.

РИТ, РИФ, ИФА и РПГА являются высокочувствительными и высокоспецифичными реакциями на сифилис. Они относятся к диагностическим подтверждающим тестам. При диагностике скрытого сифилиса целесообразна постановка двух специфических тестов одновременно.

Последовательность обследования пациентов на сифилис:

• при первичном обследовании производится постановка отборочной (скрининговой) микрореакции преципитации (МР) в количественном и качественном вариантах. В случае положительного результата используются другие специфические трепонемные тесты (РПГА, ИФА, КСР, РИФ, РИТ);
• после окончания терапии ставится МР, и по снижению титра судят о динамике инфекционного процесса и эффективности терапии. Подтверждением эффективности проведённой терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года. По окончанию этого срока осуществляется постановка той же специфической реакции, что и при первичном обследовании. Следует учитывать, что специфические трепонемные тесты могут оставаться положительными в течение ряда лет, а в отдельных случаях остаются положительными на всю жизнь.

Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (экспресс-метод). Принцип. При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген-антитело), выпадающий в виде хлопьев белого цвета.

Методика. В лунку на пластине из плексигласа (или на обычное стекло) наносят 3 капли сыворотки и добавляют 1 каплю кардиолипинового антигена. Смесь тщательно перемешивают и учитывают результаты. Положительная реакция характеризуется образованием и выпадением хлопьев разной величины; при отрицательном результате наблюдается равномерная лёгкая опалесценция. Положительная реакция микропреципитации позволяет поставить предварительный диагноз и направить пациента на дальнейшее обследование.

Для получения достоверных результатов следует пользоваться одной и той же серией препарата при обследовании больного в процессе лечения, что относится ко всем реакциям на сифилис.

К моменту снятия леченного больного с учёта неспецифические тесты с кардиолипиновым антигеном обычно негативируются, в то время как позитивность специфических реакций может наблюдаться долгое время после окончания лечения. В связи с этим данные тесты не могут служить критерием излеченности. Больные снимаются с учёта с положительными результатами РИТ. РИФ, ИФА, РПГА.

РСК (реакция Вассермана) Принцип. Реакцию ставят одновременно с двумя антигенами: 1) специфическим, содержащим антиген возбудителя (разрушенные ультразвуком трепонемы); 2) неспецифическим - кардиолипиновым. Взятие крови производят натощак или не ранее 6 часов после приёма пищи. Нельзя брать кровь у больных с повышенной температурой, после употребления спиртных напитков (не ранее, чем через 24 часа), перенесших недавно инфекционное заболевание, у женщин во время менструации, беременных в последние 10 дней беременности, рожениц в первые 10 дней после родов, новорожденных в первые 10 дней жизни. Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с кардиолипиновым антигеном. Специфические антитрепонемные антитела вступают в соединение со специфическими антигенами. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело сорбируют вводимый в реакцию комплемент. Выявление образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической системы (гемолитическая сыворотка + эритроциты барана).

Качественная методика постановки реакции Вассермана. Исследование каждой испытуемой сыворотки крови проводят в трёх пробирках с двумя антигенами (одна пробирка контрольная). Одновременно исследуют для контроля заведомо положительные (4+, 2+) и отрицательную сыворотки крови. Испытуемую сыворотку крови, разведённую 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия, разливают по 0,25 мл в три пробирки. В первую пробирку добавляют 0,25 мл трепонемного антигена, во вторую - 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенных по титру, в третью (контрольную) - 0,25 мл физ.раствора. В каждую пробирку добавляют по 0,25 мл разведённого по рабочей дозе комплемента. После первичной 45-минутной инкубации в термостате при 37° добавляют во все пробирки по 0,5 мл гемолитической системы. Лёгким встряхиванием перемешивают содержимое пробирок и помещают их в термостат при 37° на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке. Регистрируют результат реакции по наличию илу отсутствию гемолиза в опытных пробирках.

Оценка результатов. Для обозначения степени позитивности реакции Вассермана пользуются системой четырёх плюсов: полная задержка гемолиза - ++++ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - +++ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза — ++ (слабоположительная реакция); незначительная задержка гемолиза - + (сомнительная реакция). Отрицательный результат реакции характеризуется полным гемолизом во всех пробирках опыта. Оценку результатов регистрируют в книге протоколов лаборатории. Результаты реакции следует давать по каждому антигену отдельно. В случае расхождения результатов между антигенами необходимо повторить исследование новой порции сыворотки крови.

Количественная методика постановки реакции Вассермана. Определение титра реагинов и противотрепонемных антител в положительных сыворотках крови производится путём исследования в реакции связывания комплемента уменьшающихся объёмов сыворотки крови, разведённой изотоническим раствором хлорида натрия. Количественный метод постановки реакции Вассермана ставят с положительными сыворотками крови, давшими ++++ с кардиолипиновым или трепонемным антигенами.

Оценка результатов. Титром реагинов исследуемой сыворотки крови является последнее разведение, давшее задержку гемолиза.

В выдаваемых лабораторией анализах при наличии резко положительной реакции (++++) указывают с каким титром испытуемой сыворотки получена положительная реакция.

Количественное определение реагинов имеет значение при оценке эффективности противосифилитического лечения. Быстрое снижение титра реагинов свидетельствует об успешности терапии. Длительно неснижающийся титр реагинов указывает на отсутствие эффективности терапии и необходимости ее изменения.

Реакции иммобилизации бледных трепонем (РИБТ). Принцип. Угнетение движения трепонем (иммобилизация) антителами сыворотки крови пациента в присутствии комплемента.

Методика. Каждую сыворотку исследуют в двух пробирках - опытной и контрольной. В обе пробирки вносят по 0, 05 мл исследуемой сыворотки крови и по 0,35 мл антигена (взвесь бледных трепонем из раннего орхита кролика - 7-9 суток после заражения). В опытную пробирку добавляют 0,15 мл активного комплемента, а в контрольную - такое же количество инактивированной сыворотки крови морской свинки. Содержимое пробирок перемешивают лёгким встряхиванием и помещают в микроанаэростат. Микроанаэростат с пробирками помещают в термостат на 18-20 часов.

Оценка результатов. Пробирки вынимают из термостата и микроанаэростата и расставляют в штативе попарно (опытная и контрольная). Из каждой пары пробирок пастеровской пипеткой наносят капли, пронумерованные соответственно опытным пробиркам, на предметные стёкла, накрывают покровными стёклами и микроскопируют в тёмном поле. Просматривают несколько полей зрения в разных участках препарата, подсчитывая в каждом число подвижных и неподвижных бледных трепонем. В препарате подсчитывают не менее 25 трепонем и отмечают, сколько из их подвижных и сколько неподвижных. Если в контрольном препарате содержится менее 17 подвижных трепонем из 25 подсчитанных, то такой опыт не пригоден и исследование данной сыворотки крови следует повторить.

Расчёт процента специфической иммобилизации бледных трепонем производят по следующей формуле: Х=(А-В)/А 100%, где А - число подвижных бледных трепонем в контрольной пробирке; В - число подвижных бледных трепонем в опытной пробирке; X - процент иммобилизации.

В практической работе процент иммобилизации определяют по заранее составленной таблице с применением вышеуказанной формулы.

Иммуноферментный анализ (ИФА.) Принцип. Соединение комплекса «антиген-антитело» с конъюгатом, содержащим ферментную метку, которая выявляется с помощью субстратной смеси.

Методика. На твердофазном носителе (чаще лунки полистиролового планшета) зафиксирован антиген возбудителя сифилиса. В лунки добавляют сыворотку, плазму крови или ликвор пациента. 1 фаза реакции. При наличии в исследуемом материале противотрепонемных антител происходит образование ИК (антиген+антитело). 2 фаза. После удаления свободных иммуноглобулинов добавляют конъюгату. (антитела к выявляемому классу иммуноглобулинов, маркированные ферментом). В ходе инкубации на поверхности носителя происходит присоединение к имеющимся комплексам «антиген-антитело» антител, меченных ферментом. 3 фаза. После удаления свободной конъюгаты в ходе инкубации с раствором специального субстрата происходит взаимодействие фермента с субстратом, в результате чего развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител.

Оценка результата. Результат оценивается спектрофотометрически с выводом числовых данных, что исключает субъективность оценки; или визуально при отсутствии в лаборатории соответствующего оборудования. По такому принципу в настоящее время построено большинство тест-систем для диагностики сифилиса.

Поиск по сайту: