Микробиологическая диагностика легионеллеза

Легионеллы относятся к отделу Gracilicutes, семейству Legionellaceae, роду Legionella, который представлен 9 видами: L.pneumophila, L.bozemanii, L.micdadei, L.dumoffii, L gormanii,L.longbeachae, L.jordanis, L.wadsworthii, L.oakridgensis.

Легионеллы представляют собой мелкие грамотрицательные палочки длиной 2-3 мкм (иногда выделяются более крупные формы до 20-50 мкм) с выраженной тенденцией к полиморфизму. Бактерии хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе, содержат жировые включения, окрашиваемые суданом черным; по Граму окрашиваются отрицательно. Легионеллы подвижны, спор не образуют..

Бактериальная клетка легионелл обладает целым набором факторов патогенности (эндотоксин, цитотоксин, гемолизин, протеаза, действующая на белки сыворотки крови).

Легионеллы являются аэробами, хорошо растут в присутствии СО₂, весьма пребовательны к условиям культивирования; растут только на специальных сложных средах. Для культивирования требуются максимально обогащенные среды со специальными добавками, такими как L-цистеин, пирофосфат железа. Наиболее оптимальной средой является угольно-дрожжевой агар (УДА). В целом для всей группы легионелл наиболее надежным методом считается культивирование в куриных эмбрионах.

Материал для исследований может быть представлен плевральной жидкостью, реже мокротой, кровью, мочой. Для исследований также используют транстрахеальный аспират, бронхоскопический. легочный биопсийный и аутопсийный материалы.

В диагностике применяют бактериологический, биологический (более надежный), серологический методы.

Микроскопический метод. Бактерии окрашиваются по Романовскому-Гимзе и Хименсу(исключение –нативный материал из мокроты).

Для экспресс диагностики можно мазки импрегнировать серебром или люминесцентной сывороткой.

Бактериологический метод. Первичный посев производят на забуференный УДА со всеми добавками и рН 6.9.первичный материал растет медленно, поэтому чашки инкубируют в течение 2-14 дней при 35°С во влажной атмосфере. Выросшие колонии обычно менее 2 мм в диаметре, полупрозрачные, бесцветные либо с сероватым оттенком, гладкие блестящие с приподнятым краем. На средах с тирозином образуют колонии с коричневым пигментом. Некоторые виды легионелл обладают аутофлюоресценцией – УФ лучи возбуждают бело-голубое свечение. Культуру, выросшую на УДА подвергают идентификации МФА (метод флюоресцирующих антител) с использованием люминисцирующих сывороток к основным серогруппам легионелл. В спорных случаях используют анализ жирных кислот, ДНК-гомологии, иммунологическое тестирование с набором поли- и моновалентных сывороток.

Определение чувствительности к антибиотикам не рекомендуется, так как результаты исследований in vitro могут не совпадать с клинической эффективностью.

Серологическая диагностика. Наиболее распространен непрямой вариант МФА и РНГА. Также используется ИФА. Четырехкратное нарастание титров антител (сероконверсия) свидетельствует о наличии активного инфекционного процесса и позволяет с высокой степенью надежности устанавливать или подтверждать диагноз. Недостатком этих методов следует считать ретроспективный анализ диагностики, так как выраженную сероконверсию можно выявить лишь на 2-3 неделе заболевания.

Непрямой метод флюоресцирующих антител. Убитую кипячением культуру легионелл наносят на предметное стекло и фиксируют. На препарат наносят сыворотку больного с разведением 1:32 и более. После 15 минут инкубации наносят люминесцирующий иммуноглобулин против глобулинов человека, повторно инкубируют, промывают в фосфатном буфере и микроскопируют. Максимальное разведение сыворотки, в котором обнаруживается специфическое свечение, является титром специфических антител (диагностический титр-1:64).

ИФА. Применяют непрямой вариант метода.

Иммунологические экспресс методы по выявлению антигенов.