Бактериоскопическое исследование

Из гноя и осадка, полученного центрифугированием, готовят мазки на предметных стеклах и окрашивают их по Граму. При обнаружении в мазках грамположительных кокков диаметром 0,5 - 1,5, располагающихся поодиночке, парами, короткими цепочками или в виде гроздевидных скоплений, можно предположить наличие в исследуемом материале стафилококков. Расположение микробов вмазке зависит от материала, из которого приготовлен препарат. Типичные гроздевидные скопления можно увидеть в мазках, приготовленных из 1 - 2 суточной агаровой культуры. Мазки, приготовленные с бульонной культуры, обычно представлены одиночными или парными кокками. В материале из гноя встречаются одиночные кокки, которые могут располагаться в фагоцитах. В гистологических срезах обнаруживаются большие скопления в виде микроколоний. Под действием антибиотиков, различных химических соединений, при культивировании на некачественных средах образуются формы изменчивости - большие шары или мелкие д-формы.

Бактериологическое исследование (проводится в три этапа)

В качестве среды накопления используют бульон с 6,5% NaCl, разлитый в пробирки по 5 мл, в который вносят по 0,5 мл смывной жидкости.

Первичный посев материала для выделения чистой культуры производят на селективные среды: ЖСА (желточно-солевой агар), МЖСА (молочно-желточно-солевой агар). Можно использовать для выделения чистой культуры КМПА (кровяной агар).

Среды с исследуемым материалом помещают в термостат (температура 37°С) на 18-24 часа. Для лучшего выявления пигмента чашки с ЖСА, МЖСА, КМПА дополнительно выдерживают на свету при комнатной температуре еще 24 часа.

Второй этап - изучение культуральных свойств.

На КМПА стафилококки образуют непрозрачные колонии белого или золотистого цвета, гладкие, блестящие, с ровными краями, диаметром 1-3 мм с зоной полного гемолиза или без нее. При наличии лецитоветилазной активности у стафилококков на ЖСА вырастают колонии, окруженные радужным венчиком, который особенно хорошо виден при косом освещении.

Из части выросших типичных для стафилококков колоний готовят мазки на стекле, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии в мазке грамположительных кокков, оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для накопления чистой культуры и помещают в термостат в прежнем режиме на 24 часа.

Третий этап - видовая идентификация стафилококков.

Видовая идентификация стафилококков проводится на основании комплекса биологических свойств выделенной чистой культуры. Для дифференциации стафилококков от стрептококков определяют каталазную активность. Для постановки этого теста изучаемую чистую культуру помещают с помощью стеклянной палочки в каплю 3-10% раствора перекиси водорода на предметном стекле и растирают круговыми движениями, выделение пузырьков свидетельствует о присутствии стафилококков.

Стрептококки каталазной активностью не обладают.

Реакция плазмокоагуляции. Петлю суточной агаровой культуры стафилококка

суспензируют в 0,5 мл цитратной кроличьей плазмы, разведенной 1:5. Результаты реакции

регистрируют через 1, 2, 4, и 18 часа инкубации пробирок в термостате при температуре

37°С. Появление в пробирке студнеобразного сгустка свидетельствует о плазмокоагулазной активности изучаемого штамма.

Определение ДНК- азы. Суточную агаровую культуру стафилококка засевают короткими штрихами на поверхность МПА, содержащего ДНК. После инкубации посевов при 37°С в течение 18 -24 ч поверхность агара заливают 1 N раствором соляной кислоты. Вокруг колоний, продуцирующих ДНК- азу, образуется зона просветления.

Определение фосфатазы. Изучаемую культуру засевают бляшками на чашку с

фенолфталеиновым агаром и помещают в термостат (37°С) на 18 - 24 часа, после чего

выросшие колонии обрабатывают парами аммиака. Розовое окрашивание колоний

свидетельствует о фосфатазной активности стафилококка.

Ферментация углеводов и мочевины изучают на питательных средах содержащих 1% соответствующего субстрата и индикатор.

Определение ацетоина. Чистую культуру стафилококка засевают в бульон Кларка, помещают в термостат 37°С на 18 - 24 часа. После инкубации в пробирки с культурой

добавляют небольшое количество 5% спиртового раствора альфа нафтола и 40% NaOH. Результат учитывают после повторного пребывания в термостате в течение часа. При выделении ацетоина среда окрашивается в красный цвет.

Для ускоренной биохимической идентификации стафилококков можно применить микрометод, в котором используют жидкие дифференциально-диагностические среды в полистироловых планшетах. В последние годы широкое распространение получил электрофоретический метод внутривидового типирования стафилококков по спектрам образуемых ими внеклеточных белков. Для определения экзотоксинов стафилококков разработаны иммуноферментные тест - системы, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью.

Для установления источника госпитальной инфекции выделяют чистые культуры стафилококка от больных и бактерионосителей, после чего проводят их фаготипирование с помощью набора типовых стафилофагов, устанавливая идентичность фаготипов. Каждую из исследуемых культур засевают сплошным газоном на МПА в чашки Петри, подсушивают, а затем петлей нанося по капле каждого фага на квадраты соответственно количеству фагов диагностического набора. (Разметка квадратов проводится на дне чашке предварительно). Посевы инкубируют при 37°С, результаты оценивают на следующий день по наличию лизиса культуры в квадратах. В завершение исследования определяется чувствительность стафилококка к антибиоти­кам.

Таблица 1.

Поиск по сайту: