Методы выделения чистых культур аэробных, факультативно-анаэробных и облигатно-анаэробных бактерий

Методы выделения чистых культур аэробных, факультативно-анаэробных

I. Методы механического разобщения бактерий.

1. Посев материала на чашки Петри бактериальной петлёй, шпателем, пипеткой.

2. Посев пластинчатыми разводками. Готовят 10-кратные разведения материала в пробирках, затем выливают содержимое пробирок в стерильные чашки Петри, заливают 20 мл расплавленного и остуженного до 45⁰С МПА.

3. Разобщение на основе подвижности бактерий. Материал засевают в каплю конденсационной жидкости скошенного МПА. При этом подвижные бактерии «мигрируют» вверх по агаровому скосу и вырастают в виде колоний, расположенных в верхней части скошенного агара.

4. Разобщение на основе размеров МО используют для получения чистых культур вирусов и микоплазм. Чистые культуры микроорганизмов получают в фильтрах.

II. Метод заражения чувствительных лабораторных животных (биологический) основан на избирательной чувствительности животных к МО различных видов.

III. Методы, основанные на избирательной чувствительности МО к воздействию внешних факторов:

а) физических факторов:

- высокой температуры: спорообразующие бактерии родов Clostridium и Bacillus выживают при нагревании смеси микробов, а неспорообразующие - гибнут;

- низкой температуры: при пониженных температурах культивируют Y. enterocolitica, Y. pestis, L. monocytogenes;

б) химических факторов:

- кислот: кислотоустойчивые (возбудители туберкулёза) остаются в чистой культуре;

- щелочей: использование щелочной пептонной воды для выделения V. cholerae; использование 10% NaOH при выделении M. tuberculosis;

- солей: стафилококк растёт при 10–15% NaCl;

- антибиотиков: основан на избирательной чувствительности определённых видов бактерий к отдельным антибиотикам.

- красителей: красители добавляют к питательным средам для подавления роста сопутствующей флоры.

- специфических ингибиторов: среда с теллуритом калия используется для выделения C. diphtheriae, среда с селенитом натрия используется для выделения Salmonella, среды с желчьюиспользуются для выделения энтеробактерий и бактероидов.

Для выделения облигатно анаэробных МО используют следующие среды:

- анаэробный кровяной агар с гентамицином,

- анаэробный кровяной агар с неомицином и налидиксовой кислотой,

- анаэробный кровяной агар с канамицином и ванкомицином,

- фруктозо-циклосерин-цефокситиновую среду (для Clostridium difficile),

- тиогликолевую полужидкую среду,

- среду Китта-Тароцци (жидкая среда с кусочками мяса и вазелиновым маслом на поверхности),

- среду Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар). Clostridium spp. растут в глубине столбика этой среды, давая колонии чёрного цвета за счёт восстановления сернокислого натрия в сульфат натрия, который, соединяясь с хлорным железом, образует чёрный осадок сернистого железа.

Посевы облигатно анаэробных микроорганизмов культивируют в атмосфере с содержанием кислорода не более 0,1%.

а) Анаэробная камера представляет собой герметичный прозрачный бокс, перчаточный или бесперчаточный. Заполнение пространства камеры анаэробным газом трехкомпонентным (N₂ (85%– 90%) + CO₂ (5–10%) + Н₂ (5%)) или двухкомпонентным (N₂ + Н₂).

б) Микроанаэростат представляет собой цилиндрическую, герметично закрываемую металлическую или пластмассовую емкость объемом 2,5 (3–7) литров, используемую для инкубации посевов в анаэробных условиях. 1) вакуумзамещением - создают вакуум и заполняют анаэробным газом; 2) химическим связыванием кислорода. Для химического связывания кислорода используют газогенерирующие системы, которые после добавления воды генерируют Н₂ и СО₂.

в) Анаэробный пакет представляет собой прозрачный, герметично закрываемый пластиковый пакет, рассчитанный на 1–2 чашки Петри. Анаэробные условия в нем создаются химическим связыванием кислорода с безводной реакционной системой.

Исторические методы выделения анаэробов, некогда применявшиеся в практике анаэробной диагностики:

Метод Вейнберга. Высевали в пробирки с расплавленным и остуженным до 40-45⁰С сахарным агаром или средой Вильсон-Блера. Клостридии росли в виде черных колоний в толще среды.

Метод Виньяля-Вейона. Расплавленной средой Вильсона–Блера, заполняли капилляры пастеровских пипеток, концы которых запаивали и помещали в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 сут в столбике агара вырастали колонии анаэробов, которые легко изолировали, надломав капилляр выше уровня намеченной колонии.

Метод Аристовского. Посевы исследуемого материала в чашках Петри помещали в эксикатор - стеклянные емкости с притертыми краями крышки. На дно эксикатора вносили химический поглотитель кислорода: гипосульфит натрия или пирогаллол, и углекислый натрий.

Метод Фортнера. Метод совместного культивирования анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в запаянных чашках Петри.

Поиск по сайту: