Этапы молекулярно-генетических исследований

1.Взятие материала, маркировка, транспортировка, подготовка проб к исследованию, хранение.

2. Экстракция ДНК/РНК.

3. Проведение молекулярно-генетических исследований.

4. Анализ и интерпретация результатов, выдача заключения.

Оценка молекулярно-генетических методов. Преимущества: Высокая специфичность.Высокая чувствительность.Позволяют выявлять МО, присутствующие даже в небольшом количестве. Возможность осуществлять диагностику инфекций и инвазий, диагностика которых затруднена с использованием микроскопического, бактериологического методов. Возможность использования для экспресс-диагностики.Возможность полной автоматизации и высокая производительность. Низкая вероятность инфицирования персонала в процессе проведения исследований.

Недостатки: Отсутствие международных протоколов по молекулярно-генетической диагностике различных нозологических форм заболеваний. Необходимость разработки новых подходов к клинической интерпретации получаемых результатов. Высокая стоимость оборудования.

I. Молекулярная гибридизация - - м олекулярно-биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.

Назначение метода: выявление степени сходства различных ДНК. Для идентификации МО, особенно тех, которые трудно и медленно растут (микоплазмы. хламидии. вирусы)

Материал для исследования: гной; кровь; отделяемое из уретры: моча, испражнении, биопунктаты тканей и органов: объекты окружающей среды. Методы гибридизации: В растворе. В тканевых срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют НК в них и наносят гибридизационный раствор. На микрочипах (эррей гибридизация) – наиболее совершенный метод. Позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч ДНК-зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все гены. На мембранах.

Этапы:

1. Выделение ДНК.

2. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК(не более 5000 – 10000 н.о.). Проводят либо рестрикцию крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку УЗ.

3. Нанесение ДНК на мембрану и фиксация ДНК на мембране:

1) дот-блоты или слот-блоты.Перед нанесением ДНК денатурируют – превращают в 1-цепочечные. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты), либо полосок (слот-блоты).

2) саузерн-блоты.Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран. Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 80⁰С или УФ светом.

4. Гибридизацияпроводится в несколько этапов:обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны; приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд; программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 65⁰С.

5. Анализ результатов. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета.

II. ПЦР (полимеразная цепная реакция) - способ быстрого получения множественных копий специфической последовательности ДНК бактерий, грибов, вирусов до количество, достаточного для идентификации другими молекулярно-биологическими методами Назначение: индикация МО в объектах внешней среды, пищевых продуктов, материале от больных, идентификация, генетическое типирование, выявление генов вирулентности. Материал для исследования тот же.

Принцип ПЦР. После температурной денатурации двухцепочечной ДНК образуются одноцепочечные молекулы, к которым присоединяются небольшие олигонуклеотиды – праймеры. Праймеры присоединяются только к комплементарному участку ДНК на обоих цепях ДНК и ограничивают амплифицируемый фрагмент с двух сторон. К 3’концу праймера прикрепляется ДНК-полимераза и на ДНК-матрице синтезирует копию. Синтез ДНК протекает только между праймерами.

Постановка ПЦРпроводится в 5 этапов.

1. Выделение ДНК из клеток.

2. Приготовление реакционной смеси. В микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 или 0,2 мл смешивают компоненты реакционной смеси так, чтобы объем общей реакционной смеси составлял 25, 50 или 100 мкл.

Обязательные компоненты реакционной смеси:

а) раствор искомой ДНК;

б) смесь четырёх дНТФ - строительный материал ДНК;

в) термостабильная ДНК-полимераза - Taq-полимераза (не денатурирует при 96⁰С), осуществляющая полимеризацию нуклеотидов; ее получают из Termophilus aquaticus;

г) 2 синтетических праймера (прямой и обратный) - короткие, длиной 15 - 30 оснований, 1-цепочечные олигонуклеотиды, которые связываются с комплементарными структурами исследуемой ДНК;

д) специфический буфер. Для функционирования Taq-полимеразы необходимы ионы Mg⁺², определённые значение рН и концентрации солей.

3. Программирование температурного цикла и проведение амплификации заданного фрагмента ДНК в термоциклере. 1) Начальная денатурация 90-95⁰С, 3-10 мин. 2) 25-40 циклов: Денатурация 90-95⁰С, 25сек-1мин, Отжиг 48–65⁰С, 25сек-4мин, Элонгация 72⁰С, 25сек-4мин. 3. Конечная элонгация 72⁰С, 5-10 мин- образуются дуплексы ДНК. Хранение - 4⁰С.

4. Визуализация получаемых копий ДНК и регистрация результатов реакции. Электрофорез в агарозном геле, содержащем флюоресцирующий в УФ-свете ДНК-краситель - бромид этидия.

5. Анализ и интерпретация результатов реакции. Для оценки результатов учитывают опытные лунки, а также лунки с положительным и отрицательным контролем.

Экология микроорганизмов. Экологические понятия. Типы экологических связей микроорганизмов. Роль микроорганизмов в возникновении и развитии биосферы (концепция микробной доминанты). Распространение микроорганизмов в природе.

Важнейшим объектом изучения экологической микробиологии является микробиоценоз. В естественных средах (почва, вода, воздух, живые организмы) микроорганизмы живут в виде сообществ, образуя экологические связи как между собой, так и с растениями, животными и человеком, а также с абиогенными факторами окружающей среды

Нейтрализм - форма межвидовых отношений, при которой обитающие в одном биотопе популяции не оказывают друг на друга ни стимулирующего, ни подавляющего действия.

При симбиозе обе популяции извлекают для себя пользу. Степень взаимозависимости симбионтов варьирует от слабой (сотрудничество) до полной (мутуализм).

Мутуализм наблюдается в тех случаях, когда симбионты выполняют разные дополняющие друг друга жизненные функции. Например, одна популяция синтезирует продукт, которой является основой питания для другой популяции. Симбиоз наблюдается между аэробами и анаэробами, организмом человека и его собственной (аутохтонной) микрофлорой.

Коменсалы питаются остатками пищи хозяина, которые в его рационе не имеют значения. Например, коменсалы человека — аутохтонные бактерии и грибы, питающиеся спущенным эпителием или остатками органических веществ.

При конкуренции, или антагонизме, происходит подавление жизнедеятельности одной популяции другой. Антагонисты обладают способностью выделять в среду обитания вещества, которые вызывают задержку размножения или гибель компонента микробиоза. Ктаким веществам относятся антибиотики, бактериоцины, органические и жирные кислоты и др.

Паразитизм — такой вид межвидовых связей, при котором одна популяция (паразит), нанося вред другой популяции (хозяину), извлекает для себя пользу. Паразитами бактерий являются фаги. Кмикробам-паразитам человека относятся бактерии, вирусы, грибы, простейшие.

Основное положение экологии микроорганизмов -концепция о доминировании

МО в создании биосферы и её жизнедеятельности (концепция микробной доминанты)

Количество биомассы прокариотов в природных субстратах планеты – 74,5 млрд. т.,

других «живых» организмов – 57,05:

– 55,0 – растения

– 0,55 – животные

– 1,5 – водоросли и простейшие

Аутохтонная микрофлора кожи, ротовой полости, дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, её значение и методы изучения. Дисмикробиоз: причины, следствия, профилактика, принципы коррекции. Гнотобиология.

Методы изучения нормальной микрофлоры:

I. Бактериологический. Самостоятельное значение для тех биотопов, в которых обитает большое количество различных МО - полость рта, кишечника, вагины, дает общее представление а микробах.

II. Бактериологический. для тех биотопов с широким спектром МО - полость рта, кишечника, вагины. Основные принципы бактериологического методы

1. Использование качеств и количественной оценки микрофлоры

2. Первичный посев материала без обогащения.

3. Использование большого набора питательных сред, подбор условий культивирования

С современных позиций, нормальную микрофлору следует рас­сматривать как совокупность множества микробиоценозов, ха­рактеризующихся определенным видовым составом и зани­мающих тот или иной биотип в организме.

Нормальная микрофлора под­чиняется ряду основных закономерностей:

• она достаточно стабильна;

• образует биопленку, толщина которой колеблется от 0,1 до 0,5 мм.

• представлена несколькими видами, среди которых выделяют доминантные виды и виды-наполнители;

• преобладающими являются анаэробные бактерии.

Биопленка представляет собой полисахаридный каркас, состоя­щий из микробных полисахаридов и муцина, который проду­цирует клетки макроорганизма. В этом каркасе иммобилизова­ны микроколонии бактерий - представителей нормальной микрофлоры, которые могут располагаться в несколько слоев.

В состав нормальной микрофлоры входят как анаэробные, так и аэробные бактерии, соотношение которых в большинстве биоценозов составляет 10:1—100:1.

Заселение бактериями различных областей тела начинается в момент рождения человека и продолжается на протяжении всей его жизни.

Формирование качественного и количественного состава нор­мальной микрофлоры регулируется сложными антагонистиче­скими и синергическими отношениями между отдельными ее представителями в составе биоценозов.

Состав транзиторной микрофлоры может меняться в зависи­мости:

• от возраста;

• условий внешней среды;

• условий труда, рациона питания;

• перенесенных заболеваний;

• травм и стрессовых ситуаций.

В составе нормальной микрофлоры различают:

• постоянную, или резидентную микрофлору, — представлена относительно стабильным составом МО, обычно обнаруживаемых в определенных местах тела человека у людей определенного возраста;

• транзиторную, или временную микрофлору, — попадает на кожу или слизистые оболочки из окружающей среды, не вызывая заболеваний и не обитая постоянно на поверхностях тела че­ловека. Она представлена сапрофитными условно-патогенными МО, которые обитают на коже или слизистых оболочках в течение нескольких часов, дней или недель. При­сутствие транзиторной микрофлоры определяется не только поступлением МО из окружающей среды, но и состоянием иммунной системы организма хозяина и составом постоянной нормальной микрофлоры.

Стерильны:

• внутренние органы;

• головной и спинной мозг;

• альвеолы легких;

• внутреннее и среднее ухо;

• кровь, лимфа, спинномозговая жидкость;

• матка, почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре.

Наиболее богаты микроорганизмами:

• ротовая полость;

• толстый кишечник;

• верхние отделы дыхательной системы;

• наружные отделы мочеполовой системы;

• кожа, особенно ее волосистая часть.

Поиск по сайту: