Методы окраски микроорганизмов. Виды микроскопов. Принципы светлопольной, темнопольной, фазово-контрастной, люминесцентной, электронной микроскопии

Простые методы окраски мазков

Фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Сложные методы окраски мазков.

Техника иммерсионной микро­скопии.

Размеры микробов, имеющих клеточное строение, составляют 0.2 — 20 мкм (чаще 0,5 — 10 мкм) и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе. Вирусы во много раз меньше. Диаметр самых больших из них, например вируса натуральной оспы, около 300 нм, а у самых мелких составляет 20 — 30 нм. Ввиду этого для выявления вирусов используются электронные микроскопы. В микробиологических исследованиях применяют световые и электронные микроскопы.

Оптический микроскоп. Наиболее важной оптической частью микроскопа являются объективы, которые по способу использования и степени увеличения делятся на сухие и иммерсионные. Сухие объективы с относительно большим фокусными расстоянием и слабым увеличением применяются для изучения МО, имеющих крупные размеры (более 10 — 20 мкм), иммерсионные с фокусным расстоянием 1,5 — 3 мм — при исследовании более мелких МО.

При микроскопии иммерсионным объективом х90 обязательным условием является его погружение в кедровое, персиковое или при их отсутствии в вазелиновое масло, показатели преломления света у которых близки предметному стеклу, на котором делают мазки. В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив. Разрешающая способность иммерсионного микроскопа находится в пределах 0,2 мкм, а максимальное увеличение объекта достигаем 1350.

Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности – min расстояния между 2 точками, кторое можно различить. Для светлопольной микроскопии препараты должны быть окрашены. Изображение создается за счет различий в степени поглощения света разными участками окрашенного объекта.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Это достигается с помощью пара­болоид- или кардиоид-конденсора, который заменяет обычный конденсор в биологическом микроскопе. Между линзами конденсора вкладывают кружок черной фотобумаги, но периферия свободна. Исследуют неокрашенных живых МО.

Фазово-контрастная микроскопия. Основана на превращении изменений по фазе, возникающих при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом. С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превра­щаются в амплитудные и прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным фазовым контрастом — светлое изображение объекта на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособле­ние КФ-1 или КФ-4 (специальный фазовый конденсор и объектив). Исследуют живые неокрашенные МО.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции (на доли сек поглощать УФ или коротковолновые лучи и снова испускать свет) Синий в зеленый, зеленый в желтый, желтый в оранжевый, УФ в видимый свет – эффект Стокса. Первичная (собственная) люминесценция наблюдает­ся без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специаль­ными люминесцирующими красителями — флюорохромами. Используют ртутные лампы. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследова­ния живых МО и обнаружения их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности, отличие живых от мертвых, цветное изображение, разрешение при УФ до 0,1 мкм, быстрый, исследование прозрачных и непрозрачных, динамика жизненных процессов.

Поиск по сайту: