Биохимический метод идентификации

Этот метод предусматривает изучение ферментативной деградации различных субстратов с образованием промежуточных и конечных продуктов.

Сахаролитические ферменты

Амилаза: Крахмальный агар и раствор Люголя. Вокруг колоний с амилазной активностью образуется светлый неокрашенный ореол.

Карбогидразы: 1. Среды для энтеробактерий (Эндо, Левина, Плоскирева); содержат лактозу, анилиновые красители. Лактозопозитивные энтеробактерии, образуют ярко окрашенные колонии,

лактозонегнативные энтеробактерии – бледно-розовые или бесцветные колоний. 2. Полиуглеводные среды (Клиглера, Олькеницкого). Среда Клиглера имеет малиново-красный цвет и содержит: 0,1% глюкозы, 1% лактозы, соли Fe ²⁺, феноловый красный. При разложении глюкозы желтеет столбик среды, при разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении углеводов с образованием CO₂ в среде также появляются газовые пузырьки или разрыв столбика;

при образовании H₂S наблюдается почернение по ходу укола. 3. Жидкие или полужидкие моноуглеводные среды Гисса. Образуются кислые продукты, снижающие рН среды, в результате чего индикатор рН изменяет цвет. Газообразование на жидких средах приводит к накоплению газа в поплавке, в полужидких – появлению разрывов или газовых пузырьков в среде.

Протеолитические ферменты

Протеазы и пептидазы: 1. 5% обезжиренное молоко. Свёртывание с образованием сгустков казеина и пептонизация – лизис казеина, при которой молоко становится прозрачным. 2. Свернутая сыворотка, желатин. Разжижение. 3. Молочный агар. Зоны просветления.

Дезаминазы амк: Среда с одной из амк и индикатором рН; аммиак, приводящий к защелачиванию среды и изменению цвета индикатора.

Декарбоксилазы: Среда с одной из основных амк (арг, лиз, орнит, гис, тир, глн) и индикатором рН, среда подщелачивается за счёт образования диаминов, вызывая изменение цвета индикатора.

Триптофаназа: МПБ+индикаторная бумажка в щавелевой к-те. Образуется индол, который приводит к покраснению бумажки, смоченной щавелевой кислотой.

Десульфуразы (цистиназы): Среды с цис, мет и качественным реактивом на H₂S – солями железа, свинца, висмута. H₂S – почернение.

Уреаза: Среда с мочевиной и индикатором рН - феноловым красным. Образуется аммиак и окраска из красно-оранжевой переходит в малиново-лиловую за счёт защелачивания.

Липолитические ферменты

Липаза: Желточный агар или среда с твином-80. Вокруг колоний на поверхности среды видна радужная пленка.

Лецитиназа: Желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид, и вокруг колоний появляются опалесцирующие зоны, или «венчики помутнения»;

Окислительно-восстановительные ферменты

Оксидаза: Фильтровальная бумага, смоченная 1% р-ром тетраметилпарафенилендиамина. В течение 1 мин появляется пурпурно-фиолетовое окрашивание.

Каталаза: 3% раствор Н₂О₂ (нет кровяных сред). На предметном стекле появляются пузырьки.

Дегидразы: Сахарный полужидкий агар (донор Н) с 1% метиленовым синим (акцептор Н). Дегидразы способны восстанавливать некоторые органические красители, поэтому метиленовый синий обесцвечивается.

Ферменты-токсины

Гемолизины: 5-10% кровяной агар. a-гемолизины приводят к неполному гемолизу с образованием зоны неполного просветления среды, которая в течение 2-5 суток приобретает зеленовато-бурый оттенок. b-гемолизины вызывают полный гемолиз с образованием прозрачной зоны вокруг колоний. g-гемолизины не дают видимого глазом гемолиза.

Идентификация без выделения чистой культуры МО необходима для детекции возбудителей непосредственно в биологическом материале, что позволяет проводить экспресс-диагностику заболеваний, а также выявлять некультивируемые микроорганизмы. Используют два подхода:

А. Генетический. Применяют молекулярно-генетические методы (ПЦР, гибридизацию, секвенирование). Являются перспективными для идентификации любых МО и определения устойчивости к противомикробным препаратам (бактерий, вирусов), что обусловлено крайне высокой чувствительностью и быстротой получения результатов. Широко используют для идентификации длительно культивируемых бактерий (микобактерии туберкулёза), облигатных внутриклеточных паразитов (хламидий), возбудителей менингитов, а также вирусов (ВИЧ и вирусов гепатитов). Предполагается, что в будущем эти методы станут основными в диагностике.

В. Серологический. Применяют высоко специфические серологические реакции: РИФ, ИФА. Наибольшее распространение данное направление получило для:

а) идентификации в РИФ некоторых возбудителей заболеваний, передаваемых половым путём (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы);

б) идентификации в ИФА антигенов вируса гепатита В и антигенов ВИЧ.

Генетический аппарат бактерий (нуклеоид, плазмиды, IS-элементы, транспозоны): характеристика, функции, значение. Секвенирование геномов микроорганизмов. Генетическая карта. Геномика и протеомика.

Нуклеоид – длинная (1 мм) гиперспирализованная молекула ДНК. Сердцевина – 4,5S-РНК, спермин, спермидин, магний. Замкнута в кольцо. Гаплоидна. 1-3*109 Да.

Гены: структурные (1. домашнего хозяйства: метаболизма, клеточных структур. 2. вспомогательных функций: вирулентности, резистентности, биодеградации), функциональные.

Плазмиды – кольцевидная гиперспирализованная молекула ДНК (до 600 тыс н.о.), двунитевая. Размножение путем саморепликации. Может иметь сложное строение (струк гены, трансп гены, транспозоны, IS-послед). Автономные и интеграр с хромосомой (эписома). Способны к элиминации. Явление поверхностного исключения и явление несовместимости – элиминация. Контролиркет число своих копий и равномерное распределение в клетке. Способны к самопереносу (конъюгативные) или к мобилизации на перенос (неконъюгативные). Придают кл-хозяину доп. важные свойства.

Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra- опероном F-плазмиды, обеспечивающим ее конъюгативность.

R-плазмиды - устойчивость бактерий-хозяев к разнообразным лекарственным препаратам. Передача R-плазмид от одних бактерий к другим привела к их широкому распространению среди патогенных и условно-патогенных бактерий. В их состав входят: r-ген, контр синтез инактивирующего фермента, Is-последовательности, транспозоны, tra-опероны – обеспечивает перенос у Грам-.

Плазмиды биодеградации. Данные плазмиды несут информацию об утилизации некоторых органических соединений. Например, урологические штаммы кишечных палочек содержат плазмиду гидролизации мочевины.

Плазмиды патогенности. (Ent – энтеротоксин, Hly - гемолизин).

Плазмиды бактериоциногенности (Col+) – колицины, регуляция микробиоценоза и убивают патогенов.

Криптические плазмиды.

Транспозоны – нуклеотидные последова­тельности, включающие от 2000 до 20 500 пар нуклеотидов, которые несут генетическую информацию, необходимую для транспозиции. При включении в бактериальную ДНК они вызывают в ней дуплика­ции, а при перемещении — делеции и инверсии. Транспозоны могут находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы, не­способной к репликации. Копии транспозонов могут миг­рировать в некоторые плазмиды и ДНК фагов, которые, проникая в бактериальные клетки, способствуют их распространению в популя­ции. Таким образом, важнейшим свойством транспозонов является их способность к перемещению с одного репликона (хромосомная ДНК) на другой (плазмида) и наоборот. Кроме того, некоторые транс­позоны, так же как и плазмиды, выполняют регуляторную и кодиру­ющую функции. В частности, они могут нести информацию для син­теза бактериальных токсинов, а также ферментов разрушающих или модифицирующих антибиотики. В центре кодир часть, по краям IS-последовательности. Транспозиция происходит двумя путями: 1) консервативным: покидая один участок IS элемент встраивается в другой; 2) репликативным: синтезируется копия, которая встраивается в другой участок генома. Функции. Транспозоны участвуют в регуляции активности генов, инактивируя их или активируя. Осуществляют горизонтальный перенос генов, например, вирулентности или резистентности, обуславливая распространение устойчивости к антибиотикам среди микроорганизмов.

Is-последовательности – транспозируемые элемен­ты, которые также называются «вставки последовательностей осно­ваний». Это фрагменты ДНК длиной 1-2 тыс. н.о. Содержится информация, необходимая только для их транспозиции, т.е. перемещения в различные участки ДНК. Один ген – траспозазы. Значение IS элементов. 1. Участвуют в мутационной изменчивости микроорганизмов – инсерциях и делециях. 2. Являются генетическими маркерами вида или рода бактерий. 3. Являются местом распознавания и встраивания плазмид и генно-инженерных векторов. 4. Участвуют в регуляции функций генов – активации или репрессии, так как несут в своем составе промоторы или репрессоры генов или их компоненты.

Интегроны.Отвечают за сайт-специфическую рекомбинацию. Интегроны - мелкие генетические элементы, содержащие промотор и ген тирозиновой рекомбиназы - int, которая распознает и обеспечивает встраивание в сайт att I бактериальной хромосомы. Не содержат гены, отвечающие за транспозицию. Способны соединяться с кассетами генов, кодирующими резистентность и другие признаки, при этом генетические кассеты должны содержать обеспечивающие подвижность гены и элемент размером 59 п.о.

Наследственность и изменчивость микроорганизмов. Типы изменчивости. Факторы изменчивости. Мутации. Генетические рекомбинации. Фенотипическая изменчивость. Практическое значение изменчивости микроорганизмов в диагностике, терапии и профилактике инфекционных заболеваний. Понятие о генной инженерии и биотехнологии.

Модификации - фенотипические изменения какого-либо признака или не­скольких признаков МО. В отличие от мутаций они, хотя и находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вско­ре утрачиваются. Модификации возникают как адаптивные реакции отдельных микробных клеток или всей популяции в целом в ответ на изменяющиеся условия окружающей среды. Проявляются в изменении морфологических, биохимических и многих других признаков с последующей их реверси, ей к первоначальному фенотипу после устранения действия фактор вызвавшего их образование, поскольку исчезает потребность в сохранении данной модификации.

Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов, заключающийся в индукции и репрессии соответствующих структурных генов, контролируемых регуляторными гена­ми. К модификациям можно отнести включение «молчащих» генов, в результате чего происходит смена их антигеновв ходе инфекционного за­болевания. К модификациям можно отнести также запрограммированные из­менения генетической информации, в основе которых лежат миграции гена на хромосоме и встраивание его с разной частотой в определен­ные локусы, в результате чего происходит изменение признаков. Суще­ствует и механизм возврата гена к исходной локализации, что приво­дит к восстановлению этого признака. К модификациям такого рода относятся изменения антигенной структуры гонококка, трепонемы си­филиса, боррелий возвратного тифа, холерного вибриона.

Модификации могут возникать под непосредственным действием антибиотиков, например пенициллина. Образуются при этом L-формы бактерий.

Мутационная изменчивость.

Горизонтальный перенос генов – обмен генетической информацией между различными эволюционными линиями.У МО, обитающих в схожих условиях среды, и возможен даже между отдаленными систематическими группами; позволяет быстро приобретать новые свойства. Кроме того, он приводит к стиранию границ между группами МО, относящихся к разным таксономическим уровням. До 30% генома бактерий может приобретаться за счет горизонтального переноса генов. Например, у Escherichia coli 18% генов приобретены таким образом.

В основе горизонтального переноса генов лежат генетические рекомбинации -в одном направлении – от донора к реципиенту, при этом передается не вся молекула, а лишь небольшой ее участок, что приводит к формированию частичной зиготы (мерозиготы). бактерий известны три варианта рекомбинаций: конъюгация, трансдукция и трансформация.

Трансформация - разновидность рекомбинативной изменчивости МО, сопровождающаяся переносом ДНК от донора к реципиентучерез окружающую среду. В процессе трансформации ДНК-фрагмент погибшей и разрушенной бактерии встраивается в ДНК реципиента, находящегося в состоянии компетенции. Условия:

l. Наличие небольшого (до 20 генов) фрагмента 2-цепочечной ДНК донорской клетки. 1- цепочечные или меньшего размера ДНК быстро разрушается нуклеазами.

2. Наличие реципиента, находящегося в состоянии компетенции. В естественных условиях захват ДНК клеткой-реципиентом осуществляется в фазу логарифмического роста, когда продуцируется специфические ДНК-связывающие белки, кодируемые com-генами.

Стадии: 1. захват ДНК клеткой-рецепиентом. У грам- ДНК присоединяется к поверхности бактерии и поступает в ее цитоплазму по каналу, он состоит из белка-пиллина PilQ, в пептидогликане и периплазматическом пространстве из Pil E и ДНК-связывающего белка Com E, в цитоплазматической мембране - из белка Сom A. Перед поступлением в канал, состоящий из белка Сom A, 1 из 2 нитей ДНК разрушается нуклеазой. У грам+ нет наружной мембраны, и потому транспорт происходит только через клеточную стенку и ЦПМ. Канал из белка Сom GC и ДНК-связывающего протеина Com EA. На уровне ЦПМ 1 из нитей ДНК разрушается нуклеазой, а 2 транслоказой Com FA транспортируется по каналу из белка Сom ЕС в цитоплазму. 2. реципрокный обмен между донорской и реципиентной ДНК, называемый гомологичной рекомбинацией.

Трансдукция -разновидность рекомбинативной изменчивости МО, сопровождающаяся переносом генетической информации от донора к реципиенту с помощью бактериофага. Капсидная оболочка бактериофага защищает ДНК от действия нуклеаз, поэтому трансдукция, в отличие от трансформации, не чувствительна к нуклеазам.

Литические (вирулентные) фаги впрыскиваютНК в клетку и репродуцируются в ней, после чего покидают клетку путем лизиса.

Лизогенные, или умеренные фаги, инъецировав свою ДНК в клетку, могут вести двояко: 1) начать цикл репродукции и покинуть клетку путем лизиса; 2) интегрировать свою генетическую информацию в геном бактерии и в его составе передаваться дочерним клеткам. Фаги, встроенные в геном бактерий, называют профагами, а бактерии со встроенными в геном фагами, - лизогенными. Этапы:

1. Адсорбция фага к рецепторам на поверхности E. coli.
2. Проникновение хвостовой части фага через клеточную стенку и инъекция ДНК в клетку-хозяина.
3. Рекомбинация кольцевой молекулы ДНК фага с ДНК хозяина.
4. Передача профага дочерним клеткам в процессе размножения E. coli.
5. Окончание лизогении. ДНК бактериофага вырезается из бактериальной хромосомы. Происходит синтез вирусных белков и репликация ДНК фага, сопровождающиеся созреванием вирусных частиц и их выходом из клетки путем ее лизиса. Во время вырезания бактериофаг может захватывать близлежащие бактериальные гены, которые в последующем попадают в клетку реципиента.
6. Встраивание генома бактериофага, несущего бактериальные гены, в ДНК бактерии-реципиента.

Неспецифическая. Бактериофаг может встраиваться в любом месте генома бактерии.

Специфическая. Бактериофаг встраивается в строго определенные места генома.

Абортивная. Участок бактериальной хромосомы донора, перенесенный бактериофагом, не вступает в рекомбинацию с хромосомой реципиента, а остается вне хромосомы. Происходит транскрипция перенесенной ДНК, но не репликация. В процессе деления клетки донорский фрагмент переходит только в одну из дочер­них клеток и со временем утрачивается.

Конъюгация – разновидность рекомбинативной изменчивости микроорганизмов, сопровождающаяся переносом генетической информации от донора к реципиенту через непосредственный контакт (конъюгационный мостик). В естественных условиях происходит с частой 1:106.

Для грам- основной механизм горизонтальной передачи генов. Грам+ могут путем конъюгации передавать признаки, однако, основной механизм у них – трансдукция.

Необходимо выполнение следующих условий:

1. Наличие донора. Донор отличается от реципиента присутствием полового фактора F, представляющего автономно реплицирующуюся плазмиду, содержащую около25 генов, которые детерминируют: 1) процесс репликации; 2) особые структуры клеточной поверхности - половые пили, или F-пили.
2. Наличие реципиента. Не имеет плазмиды F.

Физиологические состояния F плазмиды: Автономное. Интегрированное, или Hfr. F фактор может интегрироваться в определенных местах в бактериальную хромосому, и в таком состоянии носит название эписомы. Автономное F-штрих. Интегрированная F плазмида может покидать бактериальную хромосому, захватывая близлежащие гены.

Механизм:

1. Перенос плазмиды F. Происходит при автономном состоянии F фактора. От донора к реципиенту передается только плазмида F с частотой близкой к 100%. а) Образование пары. Столкновение донора и реципиента ® прикрепление секс-пилей донора к поверхности реципиента, при этом контакт клеток происходит очень короткое время ® образование конъюгационного мостика, защищающего передаваемую ДНК от действия нуклеаз окружающей среды. б) Перенос ДНК. Происходит разрыв в определенном месте одной из цепочек F плазмиды. Разорванная цепь движется по конъюгационному мостику. В цитоплазме реципиента перенесенная цепочка ДНК достраивается второй.

2. Перенос бактериальной ДНК за счет Hfr фактора. Происходит, если F фактор интегрирован в бактериальную хромосому.В результате такой конъюгации реципиент остается F-, донор остается Hfr, а перенос полной хромосомной ДНК донора или ее фрагмента происходит с высокой частотой. а) Образование пары. б) Перенос ДНК. Происходит разрыв одной из цепочек перед местом расположения Hfr фактора. Разорванная цепочка движется внутрь клетки-реципиента 5'-концом вперед. В последнюю очередь переносится Hfr фактор. в) Сайтспецифическая рекомбинация.

3. Перенос генов фактором F-штрих. Интеграция фактора F в бактериальную хромосому обратима. В редких случаях вырезание происходит с захватом соседних участков бактериальной.

Мутации – любое стабильное наследуемое изменение ДНК.

1. По причинам возникновения: спонтанные (10-6- 10-9) и индуцированные (химические агенты ( нитрит, алкилируюшие агенты, акридиновые красители, этиленимин, азотистый или серный иприт), физические (ультрафиолетовые лучи - 260 нм, ионизирующее излучение) или биологические (бактериофаги). Под действием мутагена частота мутаций увеличивается и составляет 10-5-10-3.

2. По локализации: хромосомные, плазмидные и генные (а) точечные мутации сопровождаются заменой одного нуклеотида. Транзиции сопровождаются заменой пуринового основания на пуриновое. Трансверзии сопровождаются заменой пуринового основания на пиримидмновое. молчащими, миссенс, нонсенс. Молчащие (синонимичные) мутации, Миссенс (несинонимичные), Нонсенс мутации. б) микроинсерции или микроделеции - генные мутации, сопровождающиеся включением дополнительной пары оснований в ДНК/РНК или их утратой. Сдвиг рамки считывания.

3. По направленности: Прямые. Истинные обратные мутации – мутации, возникающие в мутированном триплете и точно восстанавливающие исходный генотип. Реверсии (супрессорные) мутации – мутации,восстанавливающие исходный фенотип. Могут происходить как в исходном гене, так и в каких-либо других участках хромосомы (интрагенные и экстрагенные супрессорные мутации).

Для выделения мутантов используют:

1. Позитивная селекция. Используют селективную среду, на которой растут только мутантные колонии.

2. Негативная селекция. Используется для выявления мутантов, утративших признаки (ауксотрофы) по сравнению с родительскими клетками (прототрофными). Для выявления ауксотрофов используют метод реплик и минимальные питательные среды.

Геномика - новое направление генетики, изучающее геномы и отдельные гены организмов на индивидуальном и популяционных уровнях для установления взаимосвязи организмов и направления их эволюции.

Структурная геномика. Определяет первичную структуру генома, границы генов и их организацию, структуру белков и других биомолекул клетки. Описывает организацию генома и протеома в целом у различных организмов. Использует методы картирования, секвенирования, рентгеноструктурного анализа, биоиформатики.

Функциональная геномика. Изучает функции каждого гена, белка и других биомолекул клетки, механизмы регуляции их активности. Оценивает роль одного гена/протеина в сложной клеточной машине. Выделяют следующие разделы: 1) транскриптомика – раздел геномики, изучающий совокупность мРНК клетки и изменения в них в зависимости от среды и стадии развития. 2) протеомика - раздел геномики, изучающий совокупность всех белков клетки, их структуру и взаимодействие друг с другом в зависимости от микроокружения и стадии развития. 3) метаболомика - раздел геномики, изучающий метаболиты и изменения в их составе в разные фазы жизненного цикла и состояния микроокружения бактерий.

Геномика может быть классифицирована на фундаментальную и прикладную.

Генная инженерия – раздел генетики, позволяющий модифицировать генетический состав организма и конструировать организмы с новыми свойствами. Для получения:

· Продуктов микробного синтеза: антибиотиков, ферментов, иммунодепрессантов;

· Рекомбинантных и векторных вакцин

· Лекарственных рекомбинантных препаратов (гормоны)

· Трансгенных животных и растений;

· МО-деструкторов, разрушающих загрязнители окружающей среды;

· Проведения генной терапии (введение нормально функционирующего гена).

Метод клонирования, заключающийся в: 1) выделении определенного гена из большого сложноустроенного генома; 2) переносе этого гена в маленький легко манипулируемый геном – вектор; 3) встраивании вектора в клетку-реципиента; 4) экспрессии гена в клетке-реципиенте.

Этапы клонирования:

Изолируют ДНК из МО-донора и нарезают ее рестриктазами на фрагменты с липкими концами.

Разрезают вектор аналогичными рестриктазами, в результате чего образуются линейные молекулы с липкими концами.

Смешивают фрагменты клонируемой ДНК с разрезанным клонирующим вектором, в результате чего образуются рекомбинантные молекулы.

Проводят электропорацию (трансформация под действием высоковольтного электрического разряда) бактерии-реципиента.

Проводят скрининг трансформантов. Способность синтезировать рекомбинантный белок трансформантом определяют в серологических реакциях, либо по приобретенной клеткой ферментативной активности.

Принципы молекулярно-генетического анализа. Методы, основанные на изучении фрагментов ДНК (плазмидное типирование, рестрикционно-эндонуклеазный анализ). Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот (молекулярная гибридизация). Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР, этапы проведения). Сферы использования молекулярно-генетических методов в микробиологии. Оценка молекулярно-генетических методов.

Задачи и цели: Диагностика инфекционных заболеваний. Химиотерапия и химиопрофилактика инфекционных заболеваний. Санитарная микробиология. Эпидемиология и инфекционный контроль. Биотехнология, в том числе вакционология. Систематика и эволюция микроорганизмов. Геномика и патогеномика.

Поиск по сайту: