Визначення генетичного матеріалу ВІЛ

Існують два основних методи якісного визначення генетичного матеріалу вірусу, що полягають у виявленні нуклеїнових кислот ВІЛ полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР): перший - дослідження провірусної ДНК у клітинах, другий - дослідження вільної вірусної РНК у плазмі крові.

Визначення провірусної ДНК методом ПЛР

З лімфоцитів і моноцитів крові дитини, що попередньо лізують, виділяють провірусні ДНК. За допомогою специфічних праймерів, розташованих у висококонсервативному регіоні ВІЛ, відбувається ампліфікація, тобто синтез великої кількості копій специфічного фрагменту провірусної ДНК. Виявляють копії провірусної ДНК гібридизаційним аналізом. Метод дуже чутливий, він дозволяє знайти одну копію провірусної ДНК на 10000 - 100000 клітин. Така висока чутливість і спеціфічність роблять метод найбільш придатним для діагностики ВІЛ-інфекції у дітей, інфікованих перинатальним шляхом. Виявлено, що 38 % ВІЛ-інфікованих немовлят мають позитивний результат за методом ПЛР у віці 48 год. Протягом першого тижня життя чутливість дослідження провірусної ДНК за методом ПЛР підвищується несуттєво. На другому тижні життя чутливість методу зростає і у 14 днів досягає 93 %. У віці 28 днів чутливість дослідження провірусної ДНК досягає 96 %, а у віці 3 - 6 місяців - 99 - 100 %.

Для виявлення провірусної ДНК ВІЛ за методом ПЛР досліджують цільну кров. Щоб уникнути руйнування клітин крові, транспортування зразка крові в лабораторію здійснюють при температурі +2...+4° C. Від моменту забору крові до її доставки в лабораторію минає не більше 24 год.

Визначення вірусної РНК методом ПЛР

З досліджуваної плазми крові виділяють вільні РНК ВІЛ, які з допомогою зворотної транскиптази перетворюють на кДНК. Метод ПЛР дозволяє одержати значну кількість копій кДНК шляхом застосування праймерів, комплементарних певним нуклеотидним послідовностям генетичного матеріалу ВІЛ. Отримані копії ідентифікують за допомогою гібридизаційного аналізу. Чутливість дослідження РНК ВІЛ за методом ПЛР приблизно така ж, як виявлення провірусної ДНК: на першому тижні життя - 25 - 40 %, далі протягом перших 2 - 3 місяців життя дитини підвищується до 90 - 100 %. Комбіноване використання методик ПЛР для виявлення провірусної ДНК і РНК ВІЛ не вивчено, але деякі дослідники рекомендують підтверджувати позитивний РНК-тест ДНК-тестом.

Хибнопозитивні результати дослідження провірусної ДНК і РНК ВІЛ за методом ПЛР можуть бути обумовлені контамінацією (забрудненням) ВІЛ досліджуваного зразка крові. Наприклад, хибнопозитивну ПЛР можуть дати зразки пуповинної крові дитини при її контамінації материнською ВІЛ-інфікованою кров'ю.

Хибнонегативні результати дослідження за методом ПЛР частіше пов'язані з порушенням умов зберігання та транспортування зразків біологічного матеріалу. Негативні результати вірусологічних тестів у ВІЛ-позитивних дітей доцільно підтверджувати негативним результатом ІФА у віці після 18 місяців.

Визначення вірусного навантаження

Вірусне навантаження визначають трьома основними методами: ПЛР із зворотною транскрипцією, методом розгалуженої ДНК і методом послідовної ампліфікації певного геному ВІЛ. Перший метод, описаний вище, полягає у синтезі кДНК на матриці вірусної РНК із наступною ампліфікацією кДНК. Другий метод передбачає фіксацію вірусної РНК із наступною ампліфікацією сигналу. Результати визначення вірусного навантаження виражають у кількості копій РНК ВІЛ у 1 мл плазми крові. ПЛР РНК ВІЛ із зворотною транскрипцією має поріг чутливості 50 копій вірусної РНК у 1 мл плазми крові. Результати цього дослідження позитивні більш ніж у 98 % ВІЛ-інфікованих. Метод розгалуженої ДНК менш чутливий, його поріг становить 500 копій вірусної РНК у 1 мл плазми крові.

Рівень вірусного навантаження - це основний прогностичний критерій, що відображає прогресування ВІЛ-інфекції; він є головним показником ефективності антиретровірусної терапії. Визначення вірусного навантаження у ВІЛ-інфікованих доцільно проводити кожні 6 місяців, якщо немає показань до більш частого визначення цього показника.

Визначення вірусного навантаження та кількості CD4⁺-T-лімфоцитів - головні критерії, які дозволяють приймати рішення про початок антиретровірусної терапії, здійснювати її контроль і виявляти показання до її зміни. Перед початком антиретровірусної терапії ці дослідження доцільно провести двічі з інтервалом 2 - 4 тижні, бажано в одній лабораторії, за відсутності у пацієнта інтеркурентних захворювань і не менш ніж через 1 - 2 місяці після активної або пасивної імунізації.

Вірусне навантаження, яке можна визначити, та подальше його підтвердження вірусологічним тестом іншого окремо взятого зразка крові дозволяють визначити діагноз ВІЛ-інфекції. Вірусне навантаження, яке не можна визначити, не дозволяє виключити діагноз ВІЛ-інфекції. Результат може бути обумовлений тим, що кількість копій вірусу у 1 мл плазми крові ВІЛ-інфікованого пацієнта нижча за поріг чутливості використаної тест-системи.

Визначення кількості CD4⁺-T-лімфоцитів

Визначення кількості CD4⁺-T-лімфоцитів дозволяє оцінити стан імунної системи й уточнити стадію ВІЛ-інфекції. Цей метод не можна використовувати для встановлення або виключення діагнозу ВІЛ-інфекції у дітей, народжених ВІЛ-інфікованими жінками. Кількість CD4⁺-T-лімфоцитів у дітей, народжених ВІЛ-позитивними жінками, може не відповідати віковим нормам як у зв'язку з ВІЛ-інфекцією, так і з інших причин, що обумовлюють порушення клітинної ланки імунітету (наприклад, первинні або вторинні імунодефіцити іншої етіології).

Більш точно процентний вміст CD4⁺-T-лімфоцитів визначають методом проточної цитофлюорометрії. Абсолютну кількість CD4⁺-T-лімфоцитів перераховують на основі визначення загальної кількості лімфоцитів і лейкоцитарної формули. При встановленні діагнозу ВІЛ-інфекції кількість CD4⁺-T-лімфоцитів доцільно контролювати кожні 3 - 6 місяців. При негативній динаміці цього показника дослідження рекомендують проводити частіше. Відсутність динаміки або зниження цього показника на фоні антиретровірусної терапії свідчить про її неефективність і необхідність зміни схеми лікування.

На додаток до рутинного тестування на антитіла до ВІЛ методом імуноферментного аналізу (ІФА), в Україні нещодавно започатковано програму тестування представників уразливих щодо інфікування ВІЛ груп населення за допомогою швидких тестів (Наказ МОЗ України, 09.06.2003 N 255 «Про затвердження методичних рекомендацій щодо застосування швидких тестів для перевірки крові на антитіла до ВІЛ, облікової форми N 498/о та інструкції щодо її заповнення»).

Швидкі тести для виявлення антитіл до ВІЛ - це діагностичні набори (тест-системи), застосування яких дозволяє отримати результат протягом кількох хвилин без використання спеціальногообладнання для проведення імуноферментного аналізу (ІФА). Матеріалом для дослідження є зразки цільної крові, сироватки або плазми крові. Розроблені та застосовуються також тест-системи для визначення антитіл до ВІЛ в зразках слини та сечі. Сучасні швидкі тести умовно розділяють на дві групи, відповідно до того, яким чином проводять аналіз. До першої групи (так звані "Dot blot"-тести) відносять діагностичні набори, при застосуванні яких досліджуваний біологічний субстрат наносять на поверхню твердої фази, кінцевий результат отримують у вигляді

забарвленої крапки або смуги. До другої групи відносять діагностичні набори, в яких "гребінку" з нанесеними антигенами занурюють в зразок, що досліджується. Більшість швидких тестів дозволяє диференційовано виявляти антитіла до ВІЛ-1 та ВІЛ-2. У самих тестах передбачена контрольна крапка або смуга, яка дозволяє перевірити коректність проведеного аналізу. Швидкі тести доцільно використовувати в ургентних ситуаціях для термінового обстеження донорської крові, а також для обстеження за добровільною згодою вагітних безпосередньо у пологових будинках, ВІЛ-статус яких до цього не було визначено. За своїми діагностичними характеристиками (чутливістю та специфічністю) сучасні швидкі тести наближаються до традиційних твердофазних ІФА-тест-систем, однак мають деякі недоліки. Основним з них є те, що отримані результати тестування оцінюють візуально, тобто має місце їх суб'єктивна інтерпретація, та оформляються документально лише особою, що провадила дослідження.

Згідно з наказом МОЗ України N 415 від 19.08.2005 р. "Про удосконалення добровільного консультування і тестування на ВІЛ-інфекцію" проводиться консультування різних групп населения.

Консультування та тестування (ДКТ) є надання добровільної консультативної допомоги населенню стосовно шляхів поширення ВІЛ-інфекції та профілактики інфікування, сприяння прийняттю добровільного інформованого рішення щодо тестування на ВІЛ, визначення ВІЛ-статусу людини, підтримка подальшої безпечної щодо інфікування ВІЛ поведінки, отримання своєчасної медичної допомоги: обстеження на туберкульоз, інфекції, що передаються статевим шляхом (ІПСШ), опортуністичні інфекції та їх лікування, своєчасний початок антиретровірусної терапії (АРТ), профілактика вертикальної трансмісії ВІЛ, послуг з планування сім'ї та всебічної підтримки (в тому числі за принципом "рівний-рівному").

ДКТ є ключовим компонентом програм профілактики та здійснення лікування і догляду за хворими на ВІЛ-інфекцію/СНІД.

Принципи ДКТ:

· Добровільність.

· Конфіденційність

· Анонімність.

· Доступність та відсутність дискримінації.

· Достовірність та повнота інформації.

· Професійна та технічна досконалість

· Мобілізація ресурсів.

Процедура консультування

Поиск по сайту: