Определение ферментов в биологических объектах. Изучение влияния температуры и рН среды на активность ферментов

Задание 1. Выявить в слюне фермент α-амилазу, который гидролизует крахмал до дисахарида мальтозы и декстринов.

α- Амилаза слюны (α-1,4-глюканогидролаза; КФ 3.2.1.1), имеет относительную групповую специфичность, расщепляет α -1,4-гликозид-ные связи в полисахаридах и не действует на дисахариды.

Принцип. Об активности фермента судят по его действию на субстрат: либо по исчезновению субстрата, либо по появлению продуктов. Расщепление крахмала обнаруживают по отрицательной реакции с реактивом Люголя.

Ход работы. В пробирку вносят 0,5-1 мл слюны, добавляют 3-5 мл 1% раствора крахмала, перемешивают и ставят в термостат при 37⁰С на 15-20 мин. После этого в пробирку вносят 3-4 капли реактива Люголя (раствор J₂ в КJ).

Задание 2. Проверить термолабильность амилазы.

Принцип: тот же.

Ход работы. В пробирку вносят 0,5-1 мл слюны, добавляют 1 мл дистиллированной воды, кипятят в пламени горелки и охлаждают; затем добавляют 3-5 мл 1% раствора крахмала, перемешивают и ставят в термостат при 37°С на 15-20 мин. После этого в пробирку вносят 3-4 капли реактива Люголя.

Задание 3. Проверить влияние рН среды на активность амилазы.

Принцип: тот же.

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5-1 мл слюны; в первую добавляют 1 мл 0,4% раствора NaOH, во вторую - 1 мл 0,4% НС1; в обе пробирки добавляют по 3-5 мл 1% раствора крахмала и ставят в термостат при 37°С на 15-20 мин. Учитывая, что NaOH реагирует с J₂ (NaOH+J₂ ® NaJ+Н₂О), перед добавлением реактива Люголя в пробирку с NaOH вносят 1 мл 0,4% HCI для нейтрализации щелочи.

Оформление работы: заполнить таблицу

Практическое значение. Изучение общих свойств является необходимым для подбора оптимальных условий действия ферментов при определении их активности в научных и клинических исследованиях. Неверно подобранные стандартные условия приводят к ошибкам при диагностике заболеваний и контроле качества ферментативных препаратов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 86-89, 106.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 115-128, 137-138.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 66-78.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 109-117.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 114-129, 139-143.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 75-83.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 53-73.

8. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – С. 34-36.

9. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін./ За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-59.

10. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 82-84.

ЗАНЯТИЕ 3

Тема: Механизм действия ферментов и кинетика ферментативных реакций. Определение активности ферментов.

Актуальность. В современной биохимии широко применяют методы определения активности ферментов в биологических жидкостях и тканях. Это позволяет установить патогенез многих заболеваний и предложить методы их лечения с использованием современных лекарственных средств.

Цель. Уметь анализировать механизмы действия ферментов и кинетику ферментативных реакций. Ознакомиться с методами качественного и количественного определения активности ферментов в биологических объектах, которые позволяют не только изучить свойства ферментов и особенности их действия и регуляции, а также составляют основу диагноза и прогноза многих заболеваний. Ознакомиться с методом определения специфичности действия ферментов α-амилазы слюны и сахаразы дрожжей.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Современные положения о механизме действия ферментов: понятие об энергии активации реакции; образование фермент-субстратного комплекса и механизмы получения продуктов ферментативной реакции (ковалентный и кислотно-основный катализ). Значение работ Е. Фишера и Д. Кошленда.

2. Кинетика ферментативных реакций: влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции (графические зависимости). Уравнение Михаэлиса-Ментен. Константа Михаэлиса, ее определение и значение.

3. Активность ферментов. Единицы измерения активности и количества ферментов: международные единицы, катал, удельная активность.

4. Факторы, которые влияют на активность ферментов: концентрация субстрата, фермента и продуктов реакции, температура, рН среды.

5. Методы выделения ферментов из биообъектов, их фракциониро-вание (ультрацентрифугирование, гель- и ионнообменная хроматография, аффинная хроматография, электрофорез) и анализ активности ферментов.

6. Методы определения активности ферментов: по количеству продукта, который образуется под действием фермента в единицу времени; по количеству израсходованного субстрата в единицу времени. Спектрофотометрические методы определения активности ферментов и визуализация результатов ферментативной реакции.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Константа Михаэлиса для фермента определяет:

А. Степень сродства фермента к продукту реакции.

В. Степень сродства фермента к субстрату.

С. Степень сродства фермента к ингибитору.

D. Среднюю скорость ферментативной реакции.

Е. Максимальную скорость ферментативной реакции.

2. Продолжите фразу «Незначительное изменение рН среды влияет на молекулу фермента, изменяя...»

А. Структурный уровень организации молекулы фермента.

В. Степень поляризации аминокислотных радикалов в активном центре

С. Толщину гидратной оболочки фермента.

D. Оптические свойства фермента.

Е. Биологическую функцию фермента.

3. Назовите показатель, который используют при определении удельной активности фермента, зная его общую активность:

А. Концентрация данного фермента в исследуемой пробе.

В. Концентрация белка в исследуемой пробе.

С. Концентрация субстрата в исследуемой пробе.

D. Константа Михаэлиса для данного фермента.

Е. Максимальная скорость исследуемой ферментативной реакции.

4. Назовите фамилию ученого, который предложил гипотезу «индуцированного соответствия».

5. Выберите фактор, который не влияет на значение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса.

А. Концентрация субстрата.

В. Химическая природа фермента.

С. Концентрация фермента.

D. Концентрация фермент-субстратного комплекса.

Е. Степень сродства фермента к субстрату.

6. В ходе ферментативного катализа при образовании фермент-субстратного комплекса:

А. Изменяется конформация субстрата

В. Изменяется конформация фермента

С. Устанавливается индуцированное комплементарное

соответствие между ферментом и субстратом

D. Сближаются функциональные группы, которые принимают

участие в катализе

7. Какое из перечисленных свойств ферментов лежит в основе их качественного и количественного определения в биологических объектах?

А. Способность проявлять максимальную активность при опреде-
ленном значении рН среды.

В. Зависимость от присутствия в среде разнообразных актива-
торов и ингибиторов.

С. Специфичность.

D. Термолабильность.

Е. Торможение реакции ее продуктами.

8. В пробирку с неизвестным субстратом добавили экстракт из дрожжей. После 15 мин инкубации смесь в пробирке дала положительную реакцию Фелинга. Какой субстрат был в пробирке?

А. Крахмал. В. Сахароза. С. Лактоза. D. Гликоген. Е. Целлюлоза.

9. Что лежит в основе механизма действия ферментов?

А. Сближение групп, которые входят в активный центр фермента.

В. Образование фермент-субстратного комплекса.

С. Изменение электрического заряда фермента.

D. Изменение пространственной конфигурации.

Е. Гидролиз фермента.

10. Укажите метод исследований, который используют для выделения ферментных систем отдельных субклеточных фракций из гомогената ткани.

11. Назовите единицу активности фермента, которая определяется количеством фермента, превращающего 1 моль субстрата в 1 с при оптимальных условиях.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Определение специфичности действия ферментов α-амилазы слюны (α-1,4-глюканогидролазы; КФ 3.2.1.1) и сахаразы дрожжей (β-D-фруктофуранозидфруктогидролазы; КФ 3.1.1.26)

Задание 1. Приготовить экстракт из дрожжей, содержащий фермент сахаразу.

Ход работы. Растереть в ступке кусочек дрожжей с 10-15 мл дистиллированной воды и профильтровать.

Задание 2. Проверить действие амилазы на крахмал и на сахарозу.

Принцип. Об активности фермента судят по его действию на субстрат: по исчезновению субстрата или появлению продуктов. Расщепление крахмала обнаруживают по отрицательной реакции с реактивом Люголя. Расщепление сахарозы обнаруживают по положительной реакции с реактивом Фелинга, которую дают продукты гидролиза сахарозы (глюкоза и фруктоза), но не дает сахароза.

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5-1 мл слюны: в первую добавляют 3-5 мл 1% раствора крахмала, во вторую – 3-5 мл 1% раствора сахарозы, перемешивают и ставят в термостат при 37°С на 15-20 мин. После этого в первую пробирку добавляют 3-4 капли реактива Люголя и убеждаются в гидролизе крахмала; с содержимым второй пробирки проводят реакцию Фелинга и убеждаются в отсутствии гидролиза сахарозы.

Техника реакции Фелинга: к1-2 мл исследуемого раствора добавляют равный объем реактива Фелинга (CuSО₄ + NaOH) и кипятят в пламени горелки. При наличии в растворе веществ моносахаридов выпадает осадок красного цвета (Сu₂О), образующийся в результате восстановления меди за счет окисления карбонильных групп моносахаридов.

Задание 3. Проверить действие сахаразы на крахмал и cахарозу.

Принцип: тот же.

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5-1 мл экстракта дрожжей; в первую добавляют 3-5 мл 1% раствора крахмала, во вторую - 3-5 мл 1% раствора сахарозы, хорошо перемешивают и ставят в термостат при температуре 37°С на 15-20 мин. После этого в первую пробирку добавляют 3-4 капли реактива Люголя и убеждаются в отсутствии гидролиза крахмала; с содержимым второй пробирки проводят реакцию Фелинга и убеждаются в наличии гидролиза сахарозы.

Оформление работы: заполнить таблицу.

Практическое значение. Ферменты, которые имеют абсолютную субстратную специфичность, используются в клинике как аналитические реагенты для определения веществ, являющихся их субстратами. Например, уреаза используется для определения мочевины в биологическом материале и лекарственных препаратах; глюкозооксидаза - для определения количества глюкозы в крови и моче. Ферменты с абсолютной и относительной групповой субстратной специфичностью имеют меньшую избирательность действия на субстраты и, как правило, принимают участие в гидролизе питательных веществ или преобразовании чужеродных соединений. Например, α-амилаза и сахараза проявляют специфичность не к структуре субстрата в целом, а к типу гликозидных связей, имеющих место в данных углеводах.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 87, 98-108.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 129-137.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 78-86, 100.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 122-137.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 129-145, 157-159.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 92-102.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 73-77, 81-84.

8. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – С. 36-43.

9. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін. / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-66.

10. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 84-88.

ЗАНЯТИЕ 4

Тема: Регуляция ферментативных процессов. Ингибиторы и активаторы ферментов. Медицинская энзимология. Количественное определение активности α-амилазы и лактатдегидрогеназы в сыворотке крови.

Актуальность. Достижения энзимологии (науки о ферментах) широко внедряются в медицину. Развитие медицинской энзимологии происходит по трем главным направлениям (энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия), что позволяет решать проблемы патогенеза энзимопатий, применять ферментные тесты для диагностики органических и функциональных нарушений органов и тканей, а также использовать ферменты и модуляторы их действия как лекарственные препараты. Так, повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови наблю-дается при рахите, опухолях костной ткани, гиперпаратиреозе, механичес-кой желтухе, вирусном гепатите, а снижение - при гипотериозе, гиповита-минозе С и др. Активность лактатдегидрогеназы повышается у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолях, остром гепатите. Ферменты используются как лечебные препа-раты (пепсин, трипсин, гиалуронидаза), как аналитические реактивы в клинико-биохимических лабораториях (глюкозооксидаза, уреаза и др.).

Цель. Выучить и уметь анализировать механизмы регуляции ферментативных процессов как основы обмена веществ в организме в норме и при патологиях, изменение их протекания при наследственных и приобретённых энзимопатиях. Ознакомиться с активаторами и ингибиторами ферментов, типами ингибирования. Рассмотреть основные аспекты энзимодиагностики и энзимотерапии. Ознакомиться с методами количественного определения активности α-амилазы и лактатдегидрогеназы сыворотки крови и их клинико-диагностическим значением.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Регуляция ферментативных процессов, пути и механизмы: аллостерические взаимодействия, ковалентная модификация ферментов, действие регуляторных белков-эффекторов (кальмодулина, протеиназ, протеиназных ингибиторов). Циклические нуклеотиды как регуляторы ферментативных реакций и биологических функций клетки.

2. Ингибиторы и активаторы ферментов. Типы ингибирования ферментов: обратимое (конкурентное и неконкурентное) и необратимое. Примеры.

3. Основные аспекты современной энзимодиагностики. Индикатор-ные, секреторные и экскреторные ферменты. Изоферменты в энзимодиагностике, тканевая специфичность распределения изоферментов. Изменения активности ферментов плазмы и сыворотки крови как диагностические показатели развития патологических процессов в органах и тканях.

4. Нарушение протекания ферментативных процессов: наследственные и приобретенные энзимопатии, врожденные недостатки метаболизма, их клинико-лабораторная диагностика.

5. Энзимотерапия – использование ферментов как лекарственных препаратов. Фармакологическое применение ферментов желудочно-ки-шечного тракта, свертывающей и фибринолитической систем крови, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем. Ингибиторы ферментов как лекарственные препараты.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Укажите активатор амилазы слюны.

2. Укажите тип ингибирования, при котором ингибитором фермента является продукт реакции.

3. Укажите фермент, активность которого следует определять в моче пациента при остром панкреатите.

4. Укажите патологию, при которой активность амилазы крови возрастает в 10 и более раз:

5. Назовите фермент, активность которого определяют в плазме крови пациентов с патологией костной ткани.

6. Для оценки степени поражения паренхимы печени у пациентов определяют:

А. Концентрацию изоформ ЛДГ₁ и ЛДГ₂ плазмы крови.

В. Концентрацию изоформ ЛДГ₄ и ЛДГ₅ плазмы крови.

С. Активность амилазы мочи.

D. Активность кислой фосфатазы.

Е. Концентрацию изоформы ЛДГ₃ плазмы крови.

7. Укажите изоформы ЛДГ, концентрация которых увеличивается в плазме крови пациентов с инфарктом миокарда:

8. Назовите фермент плазмы крови, который используют в терапевтической практике для снижения кровяного давления.

9. Какой механизм ингибирования синтеза фолиевой кислоты сульфаниламидными препаратами?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Количественное определение активности α-амилазы

в сыворотке крови методом Каравея

Задание. Определить активность α-амилазы в сыворотке крови методом Каравея.

Принцип метода. α-Амилаза (α-1,4-глюканогидролаза; КФ 3.2.1.1) катализирует гидролитическое расщепление крахмала с образованием ко-нечных продуктов, не дающих окраски с йодом. Об активности фермента судят по избытку крахмала, который определяют спектрофотометрическим методом по изменению окрашивания йод-крахмального раствора.

Реактивы: 1) Субстратно-буферный раствор (рН 7,0): 26,6 г натрия гидрогенфосфата; 8,6 г бензоатной кислоты растворяют в 500 мл дистиллированной воды, доводят до кипения; 0,4 г крахмала растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и вливают в кипящий раствор. Кипятят в течение 1 мин, после охлаждения доводят объем дистиллированной водой до 1 литра. 2) Основной раствор йода – 0,1 ммоль/л: 3,567 г калия йодата и 45 г калия йодида - растворяют в 800 мл дистиллированной воды, прибавляют 9 мл концентрированной хлоридной кислоты и доводят объем до 1 литра дистиллированной водой. 3) Рабочий раствор йода – 0,01 ммоль/л: 50 г феррум йодида, 100 мл основного раствора йода; доводят объем до 1 литра дистиллированной водой.

Ход работы. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови провести по следующей схеме:

Активность α-амилазы (Х) в г/(л∙ч) в сыворотке крови рассчитать по формуле:

Х = × 160×К,

где Ек – экстинкция контроля, Епр – экстинкция пробы, 160 – коэффициент расчета, учитывающий количество крахмала в пробе и контроле на 1 л биологической жидкости за 1 час инкубации при температуре 37°С; К – коэффициент разбавления исследуемой сыворотки крови.

Клинико-диагностическое значение. В норме активность α-амилазы в сыворотке крови составляет 12-32 г/(ч∙л). При заболеваниях поджелудочной железы наблюдают повышение активности α-амилазы в крови и моче. При остром панкреатите активность α-амилазы повышается в 10-30 раз, становится максимальной в первые сутки болезни, а на 2-6 сутки - быстро нормализуется. Гиперамилаземия также наблюдается при остром аппендиците, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки, холецистите, разрыве желчного пузыря, ожогах, травматическом шоке, пневмонии, простатите, уремии. Повышению активности α-амилазы способствуют лекарственные препараты (кортикостероиды, катехоламины, фуросемид, антикоагулянты), наркотики, алкоголь. Снижение активности наблюдают при гепатите, циррозе, злокачественных новообразованиях печени, сахарном диабете, гипотиреозе, кахексии.

Количественное определение активности лактатдегидрогеназы

(КФ 1.1.1.27) в сыворотке крови по Севелу и Товареку

Задание. Определить активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови по методу Севела и Товарека.

Принцип метода. Под влиянием ЛДГ L-лактат в присутствии никотинамидадениндинуклеотида (НАД) окисляется в пируват. Количество образовавшегося пирувата определяют фотометрически по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, в которой образуется 2,4-динитрофе-нилгидразон, имеющий красно-бурую окраску в щелочной среде. Интенсивность последнего прямо пропорциональна содержанию кетокислоты.

ЛДГ

СН₃-СН(ОН)-СООН + НАД⁺ → СН₃-СО-СООН + НАДН(Н⁺)

лактат пируват

Ход работы. В одну пробирку вносят 0,1 мл в 3 раза разбавленной сыворотки крови, 0,3 мл свежеприготовленного раствора 0,02 моль/л НАД⁺ и ставят на 5 мин на водяную баню при 37°С для нагревания смеси. В другую пробирку вносят 0,8 мл раствора 0,03 моль/л натрия пирофосфата, 0,2 мл раствора 0,45 моль/л натрия лактата и нагревают на водяной бане при 37°С. Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой и отмечают время начала инкубации. Через 25 мин реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 0,2% раствора 2,4-динитрофенилгидразина в растворе 1 моль/л хлоридной кислоты и оставляют пробирку на 20 мин при комнатной температуре для образования гидразона. К смеси прибавляют 5 мл раствора 0,4 моль/л натрия гидроксида, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 мин измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЕК при длине волны 520-560 нм в 10 мм кюветах. Контрольную пробу готовят также как и опытную, но разбавленную сыворотку прибавляют после инкубации. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.

На оси ординат откладывают значение экстинкции, а на оси абсцисс - соответствующие им единицы активности ЛДГ, которые выражены в ммоль/(л∙ч).

Клинико-диагностическое значение. Определение активности ЛДГ используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики заболеваний, а также как тест на выздоровление. В норме активность фермента в сыворотке крови составляет 0,8-4,0 ммоль/(л∙ч). Она повышается при повреждении миокарда, лейкозе, болезни почек, гемолитической и серповидноклеточной анемии, тромбоцитопении, инфекционном мононуклеозе, а также при прогрессирующей мышечной дистрофии. При болезнях, которые сопровождаются некрозом тканей (инфаркт миокарда, некротические поражения почек, гепатит, панкреатит, опухоли) наблюдают резкое повышение активности ЛДГ в сыворотке крови. При остром гепатите она повышается в первую неделю желтушного периода, при легкой и средней степени тяжести болезни - быстро нормализуется. У больных с острым инфарктом миокарда наблюдается повышение активности общей ЛДГ и ЛДГ₁ в сыворотке крови через 8-18 часов после начала приступа, которое достигает максимума через 24-72 часа. Активность ферментов остаётся высокой на протяжении первой недели и нормализуется на 6-10 день. Также имеет значение определение соотношения ЛДГ₁/ЛДГ₂, которое в норме составляет 0,4-0,74, а при остром инфаркте миокарда возрастает в 5-10 раз. При стенокардии активность ЛДГ в сыворотке крови не повышается.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 106-114.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 140-147.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 86-93, 98-102.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 137-160.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 145-157, 163-168.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 102-123.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 84-92.

8. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – С. 43-50.

9. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін. / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-66.

10. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 89-104.

ЗАНЯТИЕ 5

Тема: Общая характеристика витаминов. Жирорастворимые витамины. Качественные реакции на жирорастворимые витамины.

Актуальность. Витамины – группа органических веществ, которые имеют разное строение и физико-химические свойства, являются абсолютно необходимыми для нормальной жизнедеятельности организма и выполняют каталитическую, регуляторную или антиоксидантную функ-ции. Как правило, витамины в организме человека не синтезируются и не депонируются, а должны обязательно поступать с продуктами питания. Недостаточность витаминов приводит к развитию специфического симптомокомплекса, который называют гипо- и авитаминозом.

Цель. Ознакомиться с историей открытия витаминов и ролью отечественных ученых в развитии витаминологии. Выучить общую характеристику витаминов: биохимические закономерности их функционирования как компонентов питания человека и регуляторов ферментативных реакций и обменных процессов, классификацию по физико-химическим свойствам и клинико-физиологическому действию, понятие о витамерах и провитаминах, причины и молекулярно-биохимические механизмы возникновения гипо- и гипервитаминозов. Рассмотреть и уметь охарактеризовать жирорастворимые витамины по следующему плану: 1) название (химическое, биологическое), 2) химическая структура и ее возможные преобразования; 3) биологическая роль; 4) специфический симптомо-комплекс гипо- и авитаминоза; 5) источники и профилактическая доза.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. История открытия витаминов, роль ученых в развитии витаминологии.

2. Общая характеристика витаминов, их роль в организме.

3. Классификация витаминов по физико-химическим свойствам и клинико-физиологическому действию.

4. Провитамины, формулы известных провитаминов.

5. Общая характеристика гипо- и авитаминозов, их классификация, причины возникновения.

6. Витамины группы А и β-каротины: структура, участие в обмене веществ; источники, суточная потребность для ретинола и β-каротинов; гипо- и гипервитаминозы.

7. Витамины группы Е: структура, участие в обмене веществ; источники, суточная потребность, симптомы недостаточности.

8. Витамины группы К: структура, участие в системе свертывания крови; источники, суточная потребность. Аналоги и антагонисты витамина К как лекарственные препараты.

9. Витамины группы Д: структура, механизм действия в обмене кальция и фосфатов; источники, суточная потребность. Гиповитаминоз у детей и взрослых. Симптомы гипервитаминоза.

10. Витамин F (комплекс полиненасыщенных высших жирных кислот): структура компонентов комплекса, участие в обмене веществ; источники, суточная потребность, симптомы недостаточности.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Какой из перечисленных витаминов содержит изопреноидные фрагменты как структурный элемент?

2. Какой витамин является производным стеролов?

3. Какие витамины являются жирорастворимыми?

4. У больных с непроходимостью желчного протока возникают геморрагии, что связано с плохим усвоением витамина:

5. Врач выявил у больного увеличение времени адаптации глаз к темноте. Недостаточность какого витамина может быть причиной данного симптома?

6. Людям преклонного возраста необходимо употреблять комплекс витаминов, который содержит витамин Е. Какую главную функцию он выполняет?

7. При каком гиповитаминозе наблюдается одновременное нарушение репродуктивной функции организма и дистрофия скелетных мышц?

8. Для предупреждения послеоперационного кровотечения ребенку 6 лет рекомендовано принимать викасол, который является синтетическим аналогом витамина К. Какие посттрансляционные изменения факторов свертывания крови активируются под влиянием викасола?

А. Карбоксилирование глутаминовой кислоты.

В. Фосфорилирование радикалов серина.

С. Ограниченный протеолиз.

D. Полимеризация.

Е. Гликозилирование.

9. У больного после удаления желчного пузыря нарушились процессы всасывания кальция в кишечнике. Какой препарат надо назначить для стимулирования этого процесса?

10. Линолевая и линоленовая кислоты необходимы организму человека для синтеза эйкозаноидов. Главным источником этих кислот является:

11. Какой витамин имеет антиксерофтальмическое действие:

12. Какое нарушение в обмене веществ является характерным для рахита?

А. Окислительного декарбоксилирования пирувата.

В. Нормального отложения фосфата кальция в костной ткани при
отсутствии витамина Д.

С. Окислительного фосфорилирования, дыхания.

D. Переноса метильных групп.

13. Пациент жалуется на потерю аппетита, головную боль, плохой сон. Объективно наблюдаются гиперкератоз, воспаление глаз, выпадение волос, общее истощение организма. Из анамнеза известно, что больной продолжительное время употреблял рыбий жир. Что можно заподозрить?

14. Назовите проявление К-гиповитаминоза.

15. Мать грудного ребенка жалуется на его плохой сон, плаксивость, раздражительность, потливость, облысение затылка. Какое заболевание можно предположить?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Качественные реакции на жирорастворимые витамины

Задание 1. Провести реакцию на ретинол с концентрированной сульфатной кислотой.

Принцип. Концентрированная сульфатная кислота отнимает воду от ретинола с образованием окрашенных продуктов.

Ход работы. В сухую пробирку вносят 2 капли 0,05% масляного раствора ретинола в хлороформе (1:5) и прибавляют 1 каплю концентрированной сульфатной кислоты. Появляется красно-фиолетовая окраска, которая постепенно переходит в красно-бурую.

Задание 2. Провести реакцию на ретинол с феррум (III) сульфатом.

Ход работы. К 2 каплям 0,05% масляного раствора ретинола в хлороформе (1:5) прилить 10 капель ледяной уксусной кислоты, насыщен-ной феррум (III) сульфатом, и 2 капли концентрированной сульфатной кислоты. Появляется голубая окраска, которая постепенно переходит в розово-красную. Каротины дают в этой реакции зеленоватую окраску.

Задание 3. Провестиреакциюна кальциферол.

Принцип. При взаимодействии с анилиновым реактивом в условиях нагревания витамин Д окрашивается в красный цвет.

Ход работы. В сухую пробирку вносят 2 капли рыбьего жира и 10 капель хлороформа, а потом прибавляют при беспрерывном помешивании 2 капли анилинового реактива. Осторожно нагревают при беспрерывном помешивании и кипятят 30 с. При наличии витамина Д желтая эмульсия приобретает зеленый, а затем красный цвет.

Задание 4. Провестиреакциюна нафтохинон (витамин К₁).

Принцип. Викасол в присутствии цистеина в щелочной среде окрашивается в лимонно-желтый цвет.

Ход работы. На сухое стекло наносят 5 капель 0,05% раствора викасола, прибавляют 5 капель 0,025% раствора цистеина и 1 каплю 10% раствора натрия гидроксида. Появляется лимонно-желтая окраска.

Оформление работы: заполнить таблицу.

Практическое значение. Качественные реакции на витамины основаны на цветных реакциях, характерных для той или иной химической группы, которая входит в их структуру. Проведение таких реакций позволяет выявить витамины в лекарственных препаратах, пищевых продуктах и лекарственных растениях. Принципы, которые положены в основу качественных реакций на витамины, используются и при разработке методов их количественного определения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 399-400, 411-417.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 481-482, 494-501.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 107-124.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 426-442.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 204-220.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 124-125, 132-139.

7. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Кобилянська Л.І. та ін. / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 219-235.

8. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – С. 134, 138-142.

9. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 234-241.

ЗАНЯТИЕ 6

Тема: Водорастворимые витамины. Витаминоподобные вещества. Антивитамины. Качественные реакции на водорастворимые витамины. Количественное определение витамина С в моче и экстракте шиповника.

Актуальность. Знание роли витаминов в обмене веществ является необходимым для объяснения возникновения специфического симптомокомплекса, характерного для развития гипо- или авитаминоза, понимание возможностей и путей их предотвращения и лечения. На основе качественных проб и количественного определения витаминов и некоторых констант биологических жидкостей, которые зависят от них, можно судить о витаминной обеспеченности организма.

Цель. Выучить и уметь охарактеризовать водорастворимые витамины по следующему плану: 1) название (химическое, биологическое), 2) химическая структура и ее возможные преобразования; 3) биологическая роль; 4) специфический симптомокомплекс гипо- и авитаминоза; 5) источники и профилактическая доза. Ознакомиться с витаминоподобными веществами и антивитаминами. Ознакомиться с качественными реакциями на водорастворимые витамины и методом количественного определения витамина С.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Витамин В₁ (тиамин): строение, биологические свойства, механизм действия, роль в обмене веществ, источники, суточная потребность, симптомы недостаточности. Структура ТДФ.

2. Витамин В₂ (рибофлавин): строение, биологические свойства, механизм действия, роль в обмене веществ, источники, суточная потребность, симптомы недостаточности. Структура ФАД, ФМН.

3. Витамин В₃ (пантотеновая кислота): строение, биологические свойства, механизм действия, роль в обмене веществ, источники, суточная потребность, симптомы недостаточности. Охарактеризовать структуру HS-KoА.

4. Витамин В₅ (никотиновая кислота, никотинамид, ниацин): строение, биологические свойства, механизм действия, роль в обмене веществ, источники, суточная потребность, симптомы недостаточности. Структура НАД и НАДФ.

5. Витамин В₆ (пиридоксин): строение, биологические свойства, механизм действия, роль в обмене веществ, источники, суточная потребность, симптомы недостаточности. Структура ПАЛФ.

6. Витамин В₇ (биотин): строение, биологические свойства, механизм действия, роль в обмене веществ, источники, суточная потребность, симптомы недостаточности.

7. Витамин В₉ (фолиевая кислота): строение, биологические свойства, механизм действия, роль в обмене веществ, источники, суточная потребность, симптомы недостаточности.

8. Витамин В₁₂ (кобаламин): строение, биологические свойства, механизм действия, роль в обмене веществ, источники, суточная потребность, симптомы недостаточности.

9. Витамин С (аскорбиновая кислота): строение, биологические свойства, механизм действия, роль в обмене веществ, источники, симптомы недостаточности. Профилактическая, защитная и лечебная дозы.

10. Витамин Р (флавоноиды): строение, биологические свойства, механизм действия, проявления недостаточности, источники, суточная потребность.

11. Общая характеристика витаминоподобных веществ. Роль карнитина, убихинона и липоевой кислоты в метаболизме веществ.

12. Антивитамины: особенности структуры и действия, использование в медицине.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Гидроксипролин - важная аминокислота, которая входит в состав коллагена. При участии какого витамина происходит образование этой аминокислоты путем гидроксилирования пролина?

2. У больного - дерматит, диарея, деменция. Отсутствие какого витамина является причиной данного состояния?

3. Больному назначен пиридоксальфосфат. Для коррекции каких процессов необходим этот препарат?

А. Синтеза пуриновых и пиримидиновых оснований.

В. Окислительного декарбоксилирования кетокислот.

С. Дезаминирования аминокислот.

D. Синтеза белка.

Е. Трансаминирования и декарбоксилирования аминокислот.

4. У пациента после употребления сырых яиц развился дерматит. Недостаточность какого витамина наблюдается в этом случае?

5. У больного в крови увеличена концентрация пирувата. Значительное его количество выводится с мочой. Какой авитаминоз у больного?

6. Злокачественная гиперхромная анемия - ­болезнь Бирмера – возникает вследствие дефицита витамина B₁₂. Какой биогенный элемент входит в состав этого витамина?

7. После удаления 2/3 желудка в крови уменьшилось количество эритроцитов, увеличился их объем, снизился уровень гемоглобина. Дефицит какого витамина приводит к таким изменениям картины крови?

8. У больного наблюдается кровотечение десен. Какие витамины следует назначить?

9. При энтеробиозе назначают акрихин - структурный аналог витамина В₂. Нарушение синтеза каких ферментов у микроорганизмов вызывает этот препарат?

10. Какой витамин является составной частью кофермента, способного присоединять и отдавать водород по изоаллоксазиновому кольцу:

11. Какой витамин синтезируется в организме человека из триптофана?

12. Какой витамин входит в состав кофермента, который принимает участие в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования и рацемизации аминокислот?

13. Какой витамин является составной частью кофермента А?

14. Какой витамин оказывает влияние на проницаемость капилляров?

15. Отсутствие какого витамина вызывает болезнь, сопровождающуюся повышенной проницаемостью и хрупкостью кровеносных сосудов?

16. Больной жалуется на общую мышечную слабость, боли в участке сердца. При объективном обследовании выявлены воспалительные процессы слизистой оболочки языка и губ, кератит, васкуляризация роговицы. Что может быть причиной такого состояния?

17. Химическая природа эндогенного фактора витамина В₁₂:

18. При обследовании больного выявлено снижение кислотности желудочного сока, изменения со стороны нервной системы. При анализе крови выявлена гиперхромная анемия, наличие больших эритроцитов (мегалоцитов). Какое нарушение можно предположить?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Качественные реакции на водорастворимые витамины. Количествен-ное определение витамина С в моче и экстракте шиповника.

Задание 1. Провести качественные реакции на водорастворимые витамины. А) Диазореакция на тиамин.

Принцип. В щелочной среде тиамин с диазореактивом образует сложный комплекс оранжевого цвета.

Ход работы. К диазореактиву, состоящего из 5 капель 1% раствора сульфаниловой кислоты и 5 капель 5% раствора натрия нитрата, прибавляют 1-2 капли 5% раствора тиамина и затем по стенке, наклонив пробирку, осторожно прибавляют 5-7 капель 10% раствора натрия карбоната. На границе двух жидкостей образуется кольцо оранжевого цвета.

Б) Реакция окисления тиамина в тиохром.

Принцип. В щелочной среде тиамин окисляется в тиохром калия гексацианоферратом (III). Тиохром дает синюю флуоресценцию при ультрафиолетовом облучении раствора на флуороскопе.

Ход работы. К 1 капле 5% раствора тиамина прибавляют 5-10 капель 10% раствора натрия гидроксида, 1-2 капли 5% раствора калия гексацианоферрата (III) и взбалтывают. Предварительно прогревают флуороскоп на протяжении 10 мин и наблюдают синюю флуоресценцию при облучении раствора ультрафиолетовыми лучами.

В) Феррихлоридная проба на пиридоксин.

Принцип. При добавлении к раствору пиридоксина феррум (III) хлорида жидкость окрашивается в красный цвет (образование комплексного соединения феррум фенолята).

Ход работы. К 5 каплям 1% раствора пиридоксина прибавляют равное количество 1% раствора феррум (III) хлорида и перемешивают. Развивается красное окрашивание.

Г) Восстановление аскорбиновой кислотой калия гексацианофер-рата (III).

Принцип. Аскорбиновая кислота восстанавливает K₃[Fe(CN)₆] в K₄[Fe(CN)₆], который с феррум (III) хлоридом образует синее окрашивание или осадок - берлинскую лазурь.

Ход работы. В пробирку наливают 1 каплю 5% раствора калия гексацианоферрата (III), 1 каплю 1% раствора феррум (III) хлорида и прибавляют 5 капель 1% раствора аскорбиновой кислоты. Жидкость в пробирке приобретает зеленовато-синий цвет, на дне пробирки - синий осадок берлинской лазури.

Оформление работы: заполнить таблицу.

Задание 2. Определить содержание аскорбиновой кислоты в моче.

Принцип. Аскорбиновая кислота в кислой среде восстанавливает молекулярный йод, при этом она из восстановленной формы переходит в окисленную. Появление синего цвета свидетельствует о том, что вся аскорбиновая кислота из восстановленной формы перешла в окисленную, и первая избыточная капля раствора йода в присутствии крахмала дает синее окрашивание.

Ход работы. В колбу отмеривают 5 мл мочи и 5 мл 1н НСl, прибавляют 5 капель раствора крахмала. Титруют 0,001 н раствором йода до появления синей окраски, которая не исчезает на протяжении 30 секунд.

= ,

где а – количество 0,001н раствора йода (мл); 0,5 мкмоль аскорбиновой кислоты, что соответствует 1 мл 0,001н J₂; 1 500 – суточный диурез (мл); 5 – объём мочи в пробе (мл). В норме в сутки с мочой выделяется 284–568 мкмоль аскорбиновой кислоты.

Задание 3. Определить содержание аскорбиновой кислоты в экстракте шиповника.

Принцип. Определение основано на окислительно-восстановитель-ной реакции между аскорбиновой кислотой и 2,6-дихлорфенолиндофе-нолом, который при восстановлении переходит в лейкоформу. Для определения аскорбиновой кислоты из исследуемого продукта готовят подкисленный водный экстракт, которым титруют 2,6-дихлорфенолиндо-фенол. Подкисление витаминного водного экстракта повышает специфичность метода.

Ход работы. 150 г шиповника заливают 5 000 мл воды и оставляют на несколько часов, затем фильтруют через марлю и полученным экстрактом заполняют микробюретку. В центрифужную пробирку отмеривают микропипеткой 0,05 мл 2,6-дихлорфенол-индофенола и титруют из бюретки по каплям экстрактом шиповника, постоянно встряхивая пробирки. От первой капли содержимое пробирки краснеет (это связано с индикаторными свойствами 2,6-дихлорфенол-индофенола), титрование продолжают до полного обесцвечивания раствора.

Расчет. Содержание витамина С (Х) в мг% рассчитывают по формуле:

Х = ,

где 0,88 - титр 2,6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте (мг); 0,05 - объем 2,6-дихлорфенолиндофенола в опыте (мл); А - объем экстракта, который пошел на титрование (мл); Б - общий объем экстракта (5000 мл); В - навеска шиповника (150 г).

Практическое значение. Качественные реакции на витамины основаны на цветных реакциях, характерных для той или иной химической группы, которая входит в их структуру. Проведение таких реакций позволяет выявить витамины в лекарственных препаратах, пищевых продуктах и лекарственных растениях. Принципы, которые положены в основу качественных реакций на витамины, используются и при разработке методов их количественного определения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 400-411.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 483-494.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 124-150.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 442-464.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 220-247.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 125-132.

7. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін. / За ред. О.Я. Склярова.–К.:Здоров’я, 2002. – С. 219-235.

8. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 242-273.

ЗАНЯТИЕ 7

Тема: Биоэнергетические процессы: биологическое окисление, окислительное фосфорилирование, синтез АТФ. Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования. Ингибиторы и разобщители окислительного фосфорилирования. Определение активности каталазы крови.

Актуальность. Биологическое окисление является основным молекулярным механизмом, который обеспечивает энергетические потребности организма. Оно реализуется сложными мультиферментными комплексами внутренней мембраны митохондрий, результатом действия которых является генерация макроэргических связей в молекуле АТФ. Биологическое окисление и сопряженное с ним окислительное фосфорилирование - основа биоэнергетических процессов в организме. Изучение свойств, особенностей действия и регуляции ферментов дыхательной цепи способствует правильному пониманию патологий, обусловленных нарушением биоэнергетических процессов при гипоэнергетических состояниях (гипоксия тканей в результате снижения концентрации кислорода в воздухе, нарушение работы сердечно-сосудистой и дыхательной систем, анемии разного генеза, гиповитаминозы, голодание, действие разных ядов и др.).

Цель. Выучить биохимические основы процессов биологического окисления и окислительного фосфорилирования. Уметь трактовать роль биологического окисления, тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования в генерации АТФ в аэробных условиях; анализировать нарушение синтеза АТФ в условиях действия на организм человека патогенных факторов химического, физического, биологического происхождения; объяснить биохимические основы процессов обезвреживания эндогенных токсинов при участии ферментов микросомального окисления (цитохромов b₅ и Р-450). Ознакомиться с хемиосмотической теорией; ингибиторами и разобщителями окислительного фосфорилирования. Ознакомиться с методом определения активности каталазы крови и его клинико-диагностическим значением.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1.Взаимосвязь процессов образования и потребления энергии в живых системах. Энергия химических связей как основной вид энергии, которую используют клетки для обеспечения жизнедеятельности.

2. Реакции биологического окисления: типы реакций, ферменты (дегидрогеназы, оксидазы, оксигеназы) и их биологическое значение. Современные представления о тканевом дыхании, его стадии.

3. Современные представления о структуре и функциях митохондрий.

4. Ферменты биологического окисления в митохондриях: пиридин- и флавинзависимые дегидрогеназы, цитохромы.

5. Последовательность п

Поиск по сайту: