Определение билирубина в сыворотке крови

В клинической практике используются различные методы определения билирубина и его фракций в сыворотке крови.

Наиболее распространенным из них является биохимический метод Ендрассика-Грофа

. Он основан на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. При этом связанный билирубин (билирубин-глюкуронид) дает быструю («прямую») реакцию с диазореактивом, тогда как реакция свободного (не связанного с глюкуронидом) билирубина протекает значтельно медленнее. Для ее ускорения применяют различные вещества–акселераторы, например кофеин (метод Ендрассика-Клеггорна-Грофа), которые освобождают билирубин из белковых комплексов («непрямая» реакция). В результате взаимодействия с диазотированной сульфаниловой кислотой билирубин образует окрашенные соединения. Измерения проводят на фотометре.

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В 3 пробирки (2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы, как указано в таблице. Диазореакция

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять 20 мин, после чего измеряют на фотометре. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется. Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы. Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина.Метод Ендрассика, Клеггорна и Грофа прост, удобен в практике, не связан с применением дефицитных реактивов и является наиболее приемлемым для практических лабораторий.Определение рекомендуется приводить сразу же после забора проб, чтобы избежать окисления билирубина на свету. Гемолиз сыворотки снижает количество билирубина пропорционально присутствию гемоглобина. Следовательно, сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

Ряд веществ — гидрокортизон, андрогены, эритромицин, глюкокортикоиды, фенобарбитал, аскорбиновая кислота — вызывают интерференцию.

Постоение калибровочного графика при методе ендрассика.

Способ I — Шелонга-Вендес использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови. Основной раствор билирубина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na2CO3. Хорошо взбалтывают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором Nа2СО3 и несколько раз перемешивают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем происходит окисление билирубина. Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл свежеприготовленного основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Этот раствор содержит точно на 100 мг/л, или 171 мкмоль/л, билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении на фотометре из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости. Для приготовления компенсационной жидкости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина. К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин. Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным (как указано ниже), и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.

Для определения билирубина и его фракций в плазме крови используются различные методы, наиболее распространенным из которых является метод Ендрашика-Грофа. Метод основан на взаимодействии билирубина с сульфаниловой кислотой и азотнокислым натрием. При этом связанный билирубин дает быструю реакцию, поэтому ему дали название прямого, а свободный – более медленную реакцию, для ускорения которой применяют различные вещества (кофеин, этанол, и др., которые сначала высвобождают билирубин из белковых комплексов), поэтому он называется непрямым.

Различные методы обнаружения билирубина в моче основаны на его превращении под действием окислителей в другие вещества, имеющие зеленую или красную окраску.

Для определения билирубина используется колориметриче­ский метод, основу которого составляет реакция Ван ден Берга.

Реакция протекает в 2 стадии: на первой под воздействием соля­ной кислоты разрывается тетрапирроловая цепь, в результате чего образуются два дипиррола, на второй — оба дипирроловых производных диазотируются диазофенилсульфоновой кислотой с превращением их в азобилирубин.

Фракционное содержание билирубина определяется с помощью модифицированного мето­да Ван ден Берга, предложенного Ендрассиком.

Метод принят в качестве унифицированного.

Биогенные амины (БА) – эндогенные биологически активные производные ароматических аминокислот, участвующие в осуществлении и регуляции многочисленных и разнообразных физиологических процессов. Они хорошо известны как медиаторы передачи нервного импульса и как гормоны. Активно исследуется участие этих веществ в различных иммунологических и воспалительных реакциях [4, 41, 56].
В связи с этим определение концентрации БА в крови, моче и других биологических жидкостях важно для диагностики и мониторинга многих заболеваний и функциональных состояний организма. Кроме того, они являются специфическими маркерами развития некоторых опухолей.
Для измерения концентрации биогенных аминов используется ряд современных биохимических и иммунохимических методов, пришедших на смену недостаточно чувствительному колориметрическому определению. К ним относятся высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с флуоресцентной, электрохимической [25] и масс-спектрометрической детекцией [23] и газовая хроматография (ГХ) с масс-спектрометрической детекцией [62]. Эти методы обеспечивают высокую чувствительность, специфичность и точность измерения, однако для их использования необходимы дорогостоящее оборудование и реагенты и высококвалифицированный персонал.
Другим направлением является разработка иммунохимических методов, основанных на специфическом узнавании молекул БА молекулами соответствующих антител. К ним относятся радиоиммунологический и иммуноферментный методы анализа. Первые попытки разработки иммунохимических тестов встретили значительные трудности, так как низкомолекулярные молекулы БА практически не обладают свойствами антигенов и, даже будучи конъюгированными с белком-носителем, не вызывают образования антител, аффинность которых достаточна для достижения требуемой чувствительности анализа. Успешное решение было найдено, когда обнаружили, что ацилирование молекул БА резко усиливает их антигенные свойства. Были получены высокоаффинные поли- и моноклональные антитела к ацильным производным БА и разработана методика ацилирования молекул БА в исследуемых и контрольных образцах в процессе проведения анализа [63]. Это сделало возможным создание иммуноферментных и радиоиммунологических диагностических наборов, по чувствительности, специфичности и точности определения не уступающих хроматографическим методам, но более простых, привычных по формату для лабораторного персонала и легко поддающихся автоматизации. К ним относятся катехоламины, серотонин, гистамин.

Катехоламины (КА) – группа ароматических аминов, включающая адреналин (эпинефрин), норадреналин (норэпинефрин) и дофамин. Адреналин и норадреналин синтезируются из дофамина – производного аминокислоты фенилаланина. Основная часть адреналина синтезируется в мозговом веществе надпочечников, норадреналина и дофамина – в нервных клетках. Активная секреция адреналина и норадреналина связана с реакцией организма на стресс. При этом их концентрация в крови и моче может возрасти во много раз, после чего уровень КА в крови быстро восстанавливается, тогда как концентрация метаболитов – метанефрина и норметанефрина (вместе обозначаются как «метанефрины») – остается высокой. Уровень катехоламинов может значительно изменяться при гипертонии, кардиопатиях, депрессиях [19, 21] и многих других патологических состояниях, однако эти изменения зависят от многих факторов и часто краткосрочны.
Большое клиническое значение имеет определение КА и их производных в крови и моче при развитии ряда опухолей. Их концентрация увеличивается при развитии нейробластом, феохромоцитом и ганглионевром. Клетки этих опухолей имеют нейроэндокринное происхождение и секретируют КА и метанефрины. Даже если опухоль является доброкачественной, постоянное выделение КА в кровь может привести к тяжелым последствиям, вплоть до гибели больного. Основными симптомами являются приступы гипертонии, причину которых необходимо установить, а также головная боль, повышенное потоотделение, тахикардия. Если преобладает секреция норадреналина, симптоматика выражена слабее.
Феохромоцитомы – доброкачественные, редко злокачественные опухоли мозгового вещества надпочечников [1] – являются источником секреции КА, метанефрина и норметанефрина. Их раннее выявление очень важно, так как при своевременном обнаружении хирургическое лечение обычно является успешным [36]. Сходные опухоли, расположенные вне надпочечника (секретирующие параганглиомы), обычно выделяют норадреналин и норметанефрин. Как правило, концентрация КА и их метаболитов увеличивается как в плазме крови, так и в моче. Основное диагностическое значение имеет определение метанефринов, поскольку основная часть молекул метанефринов образуется из КА еще внутри клетки до поступления кровоток [14]. Степень возрастания уровня метанефрина и норметанефрина хорошо коррелирует с размером опухоли, в отличие от КА, уровень которых является более вариабельным [11, 16]. Основная часть метанефринов в плазме и особенно в моче находится в виде сульфоконъюгатов, и для их суммарного определения нужно провести предварительный гидролиз образца. Образование сульфоконъюгатов происходит не в надпочечниках, а главным образом в клетках желудочно-кишечного тракта, и зависит как от местной секреции КА, так и от диеты [14]. Поэтому неудивительно, что, несмотря на то, что концентрация суммарных метанефринов значительно выше, определение именно свободных метанефринов в плазме обеспечивает наибольшую клиническую чувствительность [43, 58]. Если содержание свободных метанефринов в плазме не увеличено, это с высокой степенью вероятности свидетельствует об отсутствии секретирующей КА опухоли [26, 45, 47]. Специфичность анализа значительно увеличивается, если одновременно определять метанефрин и норметанефрин и в плазме, и в моче [48, 52]. Ложноположительные реакции, связанные с влиянием лекарств, можно исключить, определяя отношения метанефрин/адреналин или норметанефрин/норадреналин (в зависимости от преобладания секреции), а также по реакции на клонидиновую пробу [12]. Проблемы, связанные с лабораторной диагностикой феохромоцитомы в моче, проанализированы в обзоре [44]; определение свободных метанефринов в моче позволяет диагносцировать опухоль с высокой клинической чувствительностью [5].
Описаны случаи резкого увеличения активности секреции адреналина у больных с феохромоцитомой при назначении глюкокортикоидов. При наличии определенных клинических симптомов (головная боль, гипертония, тахикардия, боль в области груди или живота) назначение этих препаратов, вероятно, требует предварительного обследования на наличие феохромоцитомы [51]. Увеличение уровня дофамина и его метаболита 3-метокситирамина в крови и моче наблюдается у детей при развитии нейробластомы [6, 24]. Если при клиническом обследовании возникает подозрение на наличие нейробластомы, измерение концентрации дофамина может дать лабораторное подтверждение клинических данных. Развитие нейробластомы может сопровождаться также увеличением содержания норадреналина и норметанефрина в моче; при этом показано, что отношение концентрации норадреналина [17] или ванилилминдальной кислоты [57] к концентрации дофамина в моче характеризует активность дофамин-β-гидроксилазы в клетках опухоли и может служить прогностическим показателем: чем выше это отношение, тем более дифференцированные клетки образуют опухоль. Описан случай, когда, после проведения химиотерапии, из нейробластомы образовалась опухоль, состоящая из более зрелых клеток и сходная с ганглионевромой; при этом процесс химиотерапии сопровождался повышением концентрации норметанефрина и (в меньшей степени) ванилилминдальной кислоты в моче [7].
Повышение концентрации дофамина в моче выявлено и при некоторых других заболеваниях: карциноиде (у взрослых), феохромоцитоме (у взрослых и детей), синдроме Костелло, лейкемии, синдроме Менкеса и рабдомиосаркоме мочевого пузыря (у детей). Кроме того, такое повышение может быть связано с лекарственной терапией (дофамин внутривенно, леводофа, метилдофа, клозапин, антидепрессанты, метоклопрамид) и встречается во время беременности [10]. Редкие, продуцирующие дофамин параганглиомы выявляли по увеличению содержания O-метилокситирамина (метаболит дофамина, аналогичный метанефринам) в плазме [

Серотонин, или 5-гидрокситриптамин (5-ГТ), – биогенный амин, являющийся производным триптофана. Он хорошо изучен как медиатор серотонинэргических нейронов ЦНС, участвующих в регуляции сна, аппетита, поведенческих реакций. Основная часть серотонина за пределами ЦНС находится в тромбоцитах. Кроме того, он содержится в тучных клетках, базофилах и хромаффинных клетках кишечника. Эффекты серотонина разнообразны. Он оказывает стимулирующее влияние на гладкомышечные клетки кровеносных сосудов, бронхиол, кишечника; недостаточность серотонина может привести к функциональной кишечной непроходимости. Повышенный уровень серотонина в крови обнаружен при воспалительных реакциях и активации тромбоцитов. В последнее время обнаружено и активно исследуется влияние серотонина на иммунологические процессы, в частности, миграцию клеток иммунной системы, их взаимодействие, фагоцитоз, продукцию цитокинов и т.д. [8, 22]
Повышение содержания серотонина в плазме и моче является весьма специфичным маркером карциноида ЖКТ и легких, которые составляют до 85% новообразований нейроэндокринного происхождения в ЖКТ [32]. Их развитие часто сопровождается вызванным серотонином повреждением сердечных клапанов [28]. Измеряя концентрацию серотонина, можно оценить качество проведенной операции по удалению опухоли, а также предположить наличие или отсутствие метастазов.
Маркером наличия таких опухолей также является метаболит серотонина – 5-гидроксииндолуксусная кислота [37].
Во многих исследованиях определяли содержание серотонина в тромбоцитах при депрессии [33]. Пониженный уровень серотонина был обнаружен у больных с психотическими симптомами при болезни Альцгеймера [35]. Снижение содержания серотонина в тромбоцитах при гипотиреозе коррелировало со степенью выраженности симптомов депрессии и, по мнению авторов, может служить маркером депрессивного состояния у этих больных [55]. Многочисленные исследования связывали снижение содержания серотонина со склонностью к повторному покушению на самоубийство, однако возможность использования его в качестве маркера этого состояния вызывает сомнения [38].
Надежным маркером депрессии является снижение концентрации 5-гидроксииндолуксусной кислоты в спинномозговой жидкости.

Гистамин
Гистамин – биогенный амин, хорошо известный как медиатор аллергической реакции гиперчувствительности немедленного типа. Он содержится главным образом в тучных клетках и базофильных лейкоцитах. При анафилактических и аллергических реакциях, опосредованных гистамином, его концентрация возрастает пропорционально интенсивности реакции [9, 61]. Концентрацию гистамина определяют в плазме, моче, а также супернатантах культуры клеток после контакта с аллергеном. Изменение концентрации коррелирует с эффективностью терапии специфическими антагонистами. Так, при профилактическом приеме гидроксизина и хлорферамина - антагонистов рецепторов гистамина типа H-1 и H-2 - наблюдалось снижение чувствительности больных с аллергией к мидазолам-кетаминовой анестезии и уровень гистамина в плазме не увеличивался [20].
Обнаружено повышение концентрации гистамина в плазме при проведении коронарной ангиографии у больных ишемической болезнью сердца, по-видимому, не связанное с развитием аллергических реакций, опосредованных IgE [50].
Содержание гистамина в плазме и моче увеличивается также при непереносимости гистамина, поступающего с пищей, связанного со сниженной активностью диаминоксидаз; симптомы этого состояния сходны с аллергическими [

Поиск по сайту: