Растительных белков

Гель-хроматография — метод разделения веществ, основанный на различии размеров их молекул. Метод известен под названиями «гель-проникающая», «эксклюзионная» и «молекулярно-ситовая хроматография». Последнее название наиболее полно отражает сущность метода, однако более распространен термин «гель-проникающая хроматография».

В качестве неподвижной фазы применяют гели, имеющие определенный размер пор; подвижной фазы — водные или органические элюенты. Наиболее простое объяснение механизма разделения в гель-хроматографии состоит в том, что молекулы анализируемых веществ распределены между неподвижным растворителем в порах сорбента и элюентом, протекающим через слой неподвижной фазы. Молекулы с размером, позволяющим проникать в поры сорбента при движении вдоль колонки, задерживаются в порах. Молекулы, имеющие размеры большие, чем поры, не проникают в сорбент и вымываются из колонки со скоростью движения элюента. Молекулы, проникающие в поры всех размеров, движутся наиболее медленно. Снижение скорости движения компонентов вдоль колонки прямо связано с количеством пор, в которые способны диффундировать распределяемые частицы.

Таким образом, методом гель-хроматографии можно разделять смеси веществ в зависимости от размеров их молекул. Выход компонентов из колонки происходит в порядке снижения их молекулярных масс. Вытекающие из колонки растворы анализируют различными методами, например спектрофотометрическим, фотометрическим, титриметрическим.

Наиболее широкое распространение среди носителей для гель-хроматографии белков получили сорбенты, приготовленные на основе декстрана (сефадексы, сефакрилы, молселекты), полиакриламида (биогели Р, акрилексы), агарозы (сефарозы, биогели А) и др. Набухая в воде, они образуют гели.

Номер в маркировке сефадекса означает его пористость. Выбор определенной марки сефадекса определяется молекулярной массой исследуемого белка (чем больше соответствие размеров молекул и величины пор, тем выше селективность), а степень зернения зависит от поставленной задачи. Для обессоливания растворов белков и их концентрирования обычно используют сефадексы G-25 и G-50 (грубый или средний). При разделении же смеси белков пользуются сефадексами тонкого или сверхтонкого зернения. Чем мельче частицы геля, тем эффективнее происходит разделение, но тем меньше скорость протекания раствора через колонку.

Гели готовят путем насыщения водой или элюентом в течение 5 – 20 ч соответствующего гелеобразователя (сефадекс, полиакриламид и др.). Продолжительность и температура насыщения указаны на упаковке препарата.

Проведение анализа. Колонку размерами 46,0´1,9 см заполняют сефадексом, обработанным 0,02 моль/дм³ универсальным буфером с рН 7,0. Наносят на нее 1,5 см³ раствора (7 мг/см³) белкового комплекса спиртовой дробины и элюируют тем же универсальным буфером (рН 7,0) со скоростью 12 см³/ч. Собирают фракции по 3 см³ и затем определяют в них содержание белка спектрофотометрически на СФ-46 при 280 нм.

По окончании анализа колонку промывают несколькими объемами буферного раствора. Строят профиль элюирования отдельных белковых фракций. При этом на оси абсцисс откладывают номера пробирок (фракций) или объем, прошедшей через колонку жидкости, а на оси ординат - значения оптической плотности фракций. Белки, принадлежащие к одной фракции (пик на профиле элюирования), объединяют. О числе белковых фракций судят по количеству пиков на графике. Количественное определение белка ведут по градуировочному графику.

Построение градуировочного графика: Перед использованием подготовленной к работе колонки с сефадексом проводят ее калибрование, т. е. пропускают через нее смеси окрашенных компонентов - высокомолекулярных с коэффициентом разделения К = 0 и низкомолекулярных с К = 1.

В таблице приведены характеристики нескольких чистых (маркерных) белков с известной молекулярной массой (табл. 6). Калибровочную кривую строят, используя линейную зависимость между логарифмом молекулярной массы и объемом элюата V_е, вышедшего с колонки (рис. 7).

Таблица 6

Поиск по сайту: