ГЛАВА 6. СЫВОРОТКИ

Мощным средством профилактики и терапии многих инфекционных заболеваний являются специфические, так называемые иммунные, сыворотки. Широкое распро­странение они получили и в лабораторной диагностике. В связи с этим приготовление сывороток занимает боль­шое место в общей производственной деятельности ин­ститутов вакцин и сывороток. По своему назначению сыворотки делятся на лечебно-профилактические и диаг­ностические.

Лечебно-профилактические сыворотки получают из крови иммунизированных животных или людей, в прош­лом перенесших инфекционное заболевание и сохранив­ших в организме антитела против его возбудителя. Для получения сывороток из крови животных используют, главным образом, лошадей, которых гипериммунизируют теми или иными антигенами. Некоторые институты используют для этой цели коров, мулов, ослов, коз, од­нако гораздо реже, чем лошадей.

Предназначенные для производства сывороток лоша­ди поступают из государственных животноводческих хозяйств, при условии эпизоотологического благополучия в районе их расположения. Прием лошадей производит­ся после тщательного их клинического осмотра и прове­дения необходимых аллергических, серологических и бактериологических исследований. Пригодными для сы­вороточного производства считаются лошади в возрасте от 5 до 10 лет «сухой конституции», хорошей упитанно­сти, весом не ниже 350 кг.

Отобранные для производства лошади отправляются в места их дальнейшей эксплуатации в сопровождении специально выделенных для наблюдения за ними лиц. Перед отправкой им вводят 5-10 мл столбнячного ана­токсина для создания грунд-иммунитета. В производст­венных институтах вновь прибывших лошадей помещают в карантин на три месяца. В это время проводится тща­тельное клиническое наблюдение за состоянием их здо­ровья, и осуществляются лабораторно-клинические ис­следования, имеющие целью исключить сап, бруцеллез, туберкулез, инфекционный аборт, болезни крови, глист­ные инвазии и кожные заболевания.

В первые три недели никаких антигенов им не вво­дят, кроме столбнячного анатоксина (вторая инъекция — 10-20 мл для создания грунд-иммунитета). По истече­нии двадцати одного дня, если общее состояние лошади удовлетворительное, начинается иммунизация теми или иными антигенами в зависимости от задач института. Спустя 90 дней с момента прибытия карантин снимается, и здоровые лошади переводятся в иммунизационный от­дел, где осуществляется их дальнейшая эксплуатация.

В иммунотделе все прибывшие лошади записываются в специальный журнал, который является своеобразной историей производственной жизни каждого продуцента. Поступающие в иммунотделы институтов лошади, как правило, нахо­дятся там до конца своей жизни, длительность которой, в зависимости от характера антигена, применяемого для иммунизации и схемы эксплуатации, исчисляется полуто­ра — тремя годами. Обычный конец лошадей продуцен­тов иммунных сывороток — гибель от разрыва печени вследствие ее перерождения в процессе иммунизации или от искусственно-произведенного тотального крово­пускания в тех случаях, когда дальнейшая эксплуата­ция лошади становится нерентабельной.

Лошади — продуценты сывороток — имеют специаль­ный пищевой рацион, обеспечивающий их потребности в белках, углеводах, минеральных веществах и витами­нах. В период их пребывания в иммунизационных отде­лах они постоянно находятся под наблюдением квалифи­цированных ветеринарных врачей. Каждая павшая ло­шадь подвергается вскрытию для выяснения причины гибели.

Схемы эксплуатации лошадей различны. Они опре­деляются особенностями разных видов антигенов и ха­рактером реакции лошади.

Про­цесс гипериммунизации заключается в повторных введе­ниях нарастающих количеств антигенов с более или менее длительными промежутками между инъекциями.

Подготовка лошади производится во время так назы­ваемого первого цикла иммунизации. В это время лоша­ди вводят антиген, начиная с минимальных доз (5-10 мл) и постепенно доводят количество его до 200-300 мл. Время от времени проверяют содержание анти­тел, появляющихся в сыворотке животного в результате иммунизации. Когда титр антител достигает нужного уровня, у лошади берут большое количество крови для приготовления сыворотки.

В тех случаях, когда на введение значительных объ­емов антигена лошадь в первом цикле не отвечает вы­работкой достаточного количества антител, иммуниза­цию прекращают. Чтобы приучить животное к будущим кровопусканиям, кровь берут, несмотря на низкий титр антител и так называемую нормальную сыворотку вы­пускают для приготовления питательных сред. После отдыха, предоставленного лошади, начинают второй цикл иммунизации. Этот цикл, как и все последующие, отли­чается тем, что лошадям делают две-три инъекции боль­ших доз антигена; первая из них обычно равна половине той дозы, которой закончился предыдущий цикл.

Для гипериммунизации лошадей могут применяться различные антигены; в соответствии с характером их сыворотки делятся на антитоксические и антивирусные. Антитоксические сыворотки получают от лошадей, им­мунизированных токсинами или анатоксинами, которые вводят подкожно. Для усиления антигенного раздраже­ния и замедления всасывания к токсинам-анатоксинам добавляют различные депонирующие вещества, как-то: ланолин, хлористый кальций, квасцы, тапиоку. Приме­нение этих веществ повышает эффективность иммуниза­ции и позволяет получить сыворотки с более высокими титрами. Для получения противовирусных сывороток применяются антигены, полученные от животных, зара­женных соответствующими вирусами, а также вируссодержащей жидкостью, полученной при выращивании вирусов в культурах тканей.

Введение антигенов производится с соблюдением всех правил асептики: лошадь должна быть хорошо вычище­на, место инъекции после выстригания шерсти тщательно дезинфицируется, иглы и посуда, содержащая антиген, перед употреблением стерилизуются.

В результате введения антигенов у лошади может по­вышаться температура, иногда до 39-40 °С; повышенная температура держится 1-3 дня. Местное действие анти­генов проявляется в образовании отеков и стерильных абсцессов, которые являются признаком хорошего иммунизаторного раздражения. Однако при нарушении правил асептики абсцессы могут нагнаиваться, что при­водит к затяжному подъему температуры, выводит лошадь из строя и нарушает график эксплуатации. При прочих равных условиях качество сыворотки зависит в значительной мере от антигенных и иммуногенных свойств антигенов. Поэтому в лабораториях, изготавли­вающих антигены, уделяется большое внимание изуче­нию их свойств.

Обычно максимальное накопление антител происхо­дит к 5-7 дню после последнего введения антигена. В это время и производят кровопускание. Кровь, из рас­чета 1 литр с 50 кг веса лошади, берут из яремной вены в стерильную бутыль, содержащую 10 %-ный раствор лимонно-кислого натрия в количестве, необходимом для предотвращения свертывания взятой крови. После каждого цикла иммунизации производят два, а при до­статочно высоком титре антител и три кровопускания с промежутками в 48 часов. Лошади обычно хорошо пе­реносят такие операции; белки плазмы быстро восста­навливаются, эритроциты — несколько медленнее — через 10-20 дней. После кровопускания лошади предо­ставляют отдых, во время которого и происходит восстановление утраченных белков и форменных элементов крови.

Полученная от лошадей кровь передается из иммунотдела в лабора­торию технической обработки сыворотки. Здесь жидкая часть крови отделяется на сепараторах от форменных элементов и собирается в стерильные бутыли, после чего производится дефибринирование плазмы. Сыворотку отделяют от сгустков, разливают в. бутыли, консервиру­ют хлороформом (0,5 %), фенолом (0,5 %) или хинозолом (0,025-0,05 %).

Антитоксические сыворотки выпускаются после предварительной очистки от балластных белков. Это позволяет сконцентрировать содержащиеся в них антите­ла и снизить сенсибилизирующие свойства. Кроме антитоксических сывороток очистке подвергаются и антиви­русные.

Наиболее распространенные способы очистки сводят­ся к выделению псевдоглобулина сыворотки путем осаждения сернокислым аммонием или гамма-глобулина с помощью спиртоводных осадителей.

Известно, что антитела иммунных сывороток связаны с глобулинами; альбумины являются пассивными и, сле­довательно, ненужными белками. В гипериммунных сы­воротках содержится от 55,7 до 88 % глобулинов по отношению к общему белку сыворотки. При добавлении сернокислого аммония можно осадить глобулины и пу­тем фильтрации отделить их от альбуминов. Глобулины в свою очередь могут быть разделены на эвглобулины и псевдоглобулины. При изучении насыщенности анти­телами этих субфракций было показано, что антитокси­ны и вируснейтрализующие антитела связаны, главным образом, с псевдоглобулинами. Установлено также, что обработка глобулинов, перед разделением их, ферментом пепсином позволяет в последующем при осаждении сер­нокислым аммонием выделить псевдоглобулин в более чистом виде, чем это можно сделать без предварительно­го ферментирования.

Принцип очистки и концентрации сывороток сводится к следующему:

1. Извлечение общих глобулинов. Сыворот­ка разводится в три раза дистиллированной водой и на каждый литр полученной жидкости добавляется 450 г сухого химически чистого сернокислого аммония. Выпав­шие в осадок глобулины отфильтровываются через спе­циальную фильтроткань, отжимаются на прессах для освобождения от содержащегося в них раствора соли и подвергаются диализу через полупроницаемую мембра­ну (целлофановые или вискозные мешки) против проточ­ной воды. Отфильтрованный альбумин выбрасывается, а глобулины подвергаются дальнейшей обработке.

2. Ферментация глобулинов. В полученном после диализа растворе глобулинов определяется коли­чество белка, и затем он разводится водой так, чтобы до­вести содержание белка до трех процентов. После этого к раствору глобулинов добавляется определенное коли­чество пепсина и ферментирование производится в те­чение 2-х часов сначала при рН 3,2 (1 час), затем при рН 4,2 (также один час).

3. Разделение глобулинов. По окончании ферментации к раствору глобулинов добавляется серно­кислый аммоний из расчета 140 г на 1 литр. Смесь про­гревается при 58 °С в течение 45 минут. Осажденный эвглобулин отфильтровывается и выбрасывается. К фильтрату, содержащему сильно разбавленный псев­доглобулин, после подщелачивания до рН 7,0-7,1 до­бавляется сернокислый аммоний из расчета 200 г на 1 литр. Образовавшийся осадок псевдоглобулина от­фильтровывается, прессуется в подвергается диализу,

Полученная после диализа жидкость представляет собой концентрированный раствор псевдоглобулина. Для более полной очистки он дополнительно обрабатывается хлороформом и соляной кислотой. Хлороформ добавля­ется в количестве 30 % к объему раствора после установ­ления в нем рН 6,5-5,7, соляная кислота — в количе­стве, установленном специальной предварительной пробой. Выпавшие балластные белки удаляются центри­фугированием в специальных центрифугах или с помо­щью сепараторов.

Стандартизация сыворотки. Этот процесс имеет целью придать полученному очищенному псевдо­глобулину стандартные показатели, касающиеся содер­жания белка, значения рН и изотоничности раствора.

После определения исходного количества белка, псев­доглобулин разводится физиологическим раствором так, чтобы довести содержание белка до 17 %, рН устанавли­вается равным 7,0, количество хлористого натрия дово­дится до 0,85 %. Затем сыворотка освобождается от хло­роформа (после этой операции он снова добавляется к сыворотке в строго определенном количестве, равном 0,5 %, уже как консервант) и подвергается стерилизую­щей фильтрации через бактериальные фильтры. В про­цессе производства контролируется стерильность, без­вредность (включая определение апирогенности), устанавливается титр сыворотки, проверяются ее физические свойства. После проведения всех необходимых контро­лей препарат передается в цех разливки.

Готовая сыворотка представляет собой прозрачную жидкость, иногда полностью бесцветную, иногда окра­шенную в желтоватый или зеленоватый цвет.

Сыворотка сохраняется при температуре 4-10 °С, срок годности ее 2 года. По истечении этого срока препа­рат, если он хранился в надлежащих условиях и не из­менил своих физических свойств, может быть подверг­нут повторному контролю в ближайшем Институте вакцин и сывороток. При сохранении титра и остальных показателей срок годности может быть продлен на 1 год с момента повторного контроля.

Сыворотки, подвергшиеся замораживанию и оттаи­ванию, если они при этом не потеряли своих физических свойств, признаются годными к употреблению.

Признаки непригодности сывороток: резкое помутнение, содержание неразбивающихся хлопь­ев, наличие посторонних включений.

Сушка сывороток. В принципе процесс высушивания сывороток не отличается от описанного выше процесса сушки вакцин и диагностических препаратов. Разница заключается в технической стороне дела, так как сыворотки должны высушиваться в значительно больших объёмах. Первый аппарат СБОС (сушка больших объемов сыворотки) может высушить в одной емкости до 20 литров очищенных сывороток. Установка состоит из сублиматора с вакуумным насосом и холодильного агрегата. Сублиматор предназначен для замораживания сыворот­ки и ее высушивания. Конденсатор улавливает пары, образующиеся при сушке, и замораживает их. В холодильном аппарате производится охлаждение переносчика холода (раствора хлористого кальция), ко­торый в процессе сушки непрерывно подается в сублиматор и конденсатор. Перед началом сушки сублиматор стерилизуется пропусканием пара и после того, как он остынет, в него подается стерильная сыворотка.

После заполнения сывороткой сублиматор присоеди­няется к устройству, подающему охлаждающую смесь с температурой -37 °С …-40 °С, и при помощи мотора на­чинает вращаться со скоростью 10 оборотов в минуту. В этих условиях происходит намораживание сыворотки на внутренней цилиндрической поверхности сублимато­ра. По окончании намораживания подача охлаждающей смеси в рубашку сублиматора прекращается, и он сое­диняется с охлажденным конденсатором, в котором соз­дан вакуум. Измерение температуры корпуса сублимато­ра и намороженного на нем слоя сыворотки производит­ся с помощью вмонтированных термопар. Через 20-25 часов после начала сушки для ускорения ее начинается подогрев сублиматора с помощью воды, подаваемой из бойлера с автоматическим терморегулятором. Темпера­тура сублиматора и сыворотки постепенно повышается до 37- 40 °С. После окончания сушки, сублиматор заполняется сухим стерильным воздухом. При помощи спе­циального устройства, вмонтированного в аппарат, сухая сыворотка соскребается со стенок сублиматора и раз­мельчается путем вращения его. Затем через разгрузочное отверстие сыворотка пересыпается в стерильный стеклянный контейнер, который при соблюдении правил стерильной работы закрывается плотной резиновой пробкой.

Коллекторные аппараты состо­ят из конденсатора с ловушкой паров влаги, коллектора с отводками, к которым с помощью вакуумной резины присоединяются 20-25 колб емкостью по 3 литра, ва­куумного насоса и 2 ванны со змеевиками. Сыворотка разливается в стерильные колбы по 0,5-0,7 литра, после чего они погружаются в охлаждающую смесь темпера­турой –20 С°…-25 С°. Намораживание сыворотки тонким слоем на стенках колб обеспечивается вращением их. Когда сыворотка замерзнет, колбы помещают в смесь с более низкой температурой (-50 С°…-80 °С) на 1,5-2 часа. По истечении этого времени ватные пробки в кол­бах заменяются стерильными резиновыми с пропущен­ными через них металлическими штуцерами, на которых надета вакуумная резина для. присоединения к кол­лектору. Благодаря вакууму, создаваемому в коллекто­ре, происходит удаление влаги из сыворотки. Незадолго до окончания сушки колбы подогревают теплой водой до 30-35 °С. Процесс высушивания 13-15 литров сыворотки на этой уста­новке продолжается 16-20 часов. По окончании сушки колбы с перекрытыми шлангами снимают с коллектора, переносят в стерильный бокс, где, соединив с воздуш­ным ватным фильтром, заполняют сухим воздухом. Су­хая сыворотка из колб пересыпается в стерильные широкогорлые бутыли, в которых она и сохраняется под плотными резиновыми пробками. Разлитая в ампулы готовая сыворотка высушивается аналогичным спосо­бом либо в камерных, либо на коллекторных аппаратах.

Высушенные препараты хранятся в сухом, темном помещении при температуре, не превышающей 20 °С. Срок хранения сыворотки не ограничен.

Поиск по сайту: