ГЛАВА 9. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ. ДИАГНОСТИКУМЫ И АНТИГЕНЫ

Диагностические препараты применяются для следующих целей:

1) для определения с помощью специфических иммунных сывороток вида или типа микроба выделенного от больного, носителя или из объектов внешней среды;

2) для обнаружения с помощью диагностикумов анти­тел в сыворотке больных или реконвалесцентов;

3) для выявления с помощью аллергенов перестройки организ­ма, возникающей при некоторых инфекционных заболе­ваниях.

Все диагностические препараты представляют собой антигены или антитела.

Общие сведения о диагностикумах

Диагностикумы — это взвеси убитых микробов, чаще всего в физиологическом растворе, применяемые в ка­честве антигенов для серологических реакций.

Преимущество диагностикумов перед живой культу­рой заключается в стабильности их агглютинабильных свойств, стандартности, безопасности и простоте обращения с ними. Использование диагностикумов дает воз­можность широко применять серологические методы в практике массовой работы. Особое значение имеют диагностикумы в случаях, когда работа с живыми бак­териями или вирусами опасна из-за их высокой инфекционности (например, с бруцеллами, туляремийными бактериями, вирусами клещевого и японского энцефали­тов и др.).

Диагностикумы, используемые для распознавания инфекционных заболеваний, делятся на бактерийные, риккетсиозные и вирусные. С их помощью в сыворотке больных можно определить наличие антител по отноше­нию к определенному виду микроба-возбудителя.

Более тонкие различия антител в изучаемой сыворот­ке устанавливают при помощи специфических монодиагностикумов. Так, при брюшном тифе для определения групповых О-антител и видовых Н-антител применяются соответствующие О- и Н- диагностикумы из культуры брюшнотифозных бактерий 0-901 или бактерий парати­фа № 2, обладающих общим О-антигеном с брюшноти­фозными бактериями; Н-диагностикум представляет со­бой взвесь бактерий, обладающих выраженной подвиж­ностью.

Бактерийные диагностикумы

Для приготовления бактерийных диагностикумов бе­рется агаровая суточная культура определенного вида микроба, находящегося в S-форме.

Культуры должны агглютинироваться соответствую­щими эталонными сыворотками в разведении до титра, определяемого реакцией агглютинации на три креста, а также быть типичными по морфологическим и биохи­мическим свойствам. Агглютинация с гетерологичными сыворотками в разведении выше 1/8 титра не должна иметь места.

Производство диагностикумов, как и всех биологи­ческих препаратов, требует стерильных условий.

Проверенные 18—20-часовые агаровые культуры или 4-часовые бульонные засевают на матрацы с агаром, приготовленным на мясном, дрожжевом или казеиновом гидролизате. Через 18—20 часов инкубации в термоста­те при 37 °С из культур делают мазки (с каждого матра­ца отдельно) для проверки чистоты. Затем культуру смывают физиологическим раствором иполученную взвесь разных штаммов одного вида микробов сливают в одну градуированную бутыль. При массовом произ­водстве применяется котловой метод выращивания бактерий. Диагностикумы готовят из разных количеств штаммов соответствующих микробов.

Густоту маточной взвеси определяют по оптическому стандарту. Допускается получение маточной взвеси, со­держащей в 1 мл 10 млрд. микробных тел. Далее маточ­ная взвесь инактивируется.Инактивацию можно прово­дить различными способами: прогреванием, действием формалина,алкоголя и др. Так, для определения фаго­цитарной активности лейкоцитов диагностикумы гото­вят из микробов, убитых нагреванием, так как фенол или формалин обусловливают отрицательный хемотаксис лейкоцитов.

При изготовлении формалинизированных диагностикумов к 10-миллиардной взвеси добавляют разные коли­чества формалина в зависимости от вида диагностикума. После прибавления формалина бутыль закрывают рези­новой пробкой, тщательно встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 18—20 часов или оставляют на 2 суток при комнатной температуре. По истечении этого срока производят посев для определения стерильности, после чего проверяют агглютинабильностьматочной взвеси с гомологичными сыворотками. Маточную взвесь разводят формализированным 0,1 % физиологическим раствором до густоты в 3 млрд. по оптическому стан­дарту. После разведения диагностикума снова произ­водят контроль на стерильность.

Для изготовления спиртового диагностикума суточ­ная культура О-штамма смывается с матрацев физиоло­гическим раствором, содержащим 0,5 % карболовой кис­лоты. Маточная взвесь разводится до густоты 4-х млрд. в 1 мл.Для разведения применяется смесь карболизированного физиологического раствора с 96 % этиловым спиртом, взятым в соотношении 1:2. Спирт предварительно фильтруется через бактериальный фильтр. Содержимое бутылей тщательноперемешивается. Диагностикум помещается на 48 часов в термостат при 37 °С и затем оставляется на трое суток при комнатнойтемпературе. Спиртовые диагностикумы также контролируются на стерильность.

Готовый диагностикум проверяют на агглютинабильность гомологичной агглютинирующей сывороткой идля выявления групповых агглютининов — гетерологич­нымисыворотками. Кроме того, диагностикум испыты­ваютв реакции агглютинации с сыворотками здоровых людей (5 сывороток). Реакцию агглютинации с диагностикумами ставят по классической методике.

Готовые диагностикумы разливают в ампулы по 5 или 10 мл; они, как правило, содержат 3 млрд. микроб­ных тел в 1 мл за исключением туляремийного, содер­жащего 50 млрд. бактерий в 1 мл, и бруцеллезного ди­агностикума, содержащего 20 млрд. микробных тел в 1 мл. После контроля производят этикетировку препа­рата. Диагностикумы годны в течение года с момента разведения маточной взвеси.

Формалинизированные Н-диагностикумы дают круп­нохлопчатую Н-агглютинацию, при которой хлопья лег­ко разбиваются, в связи с чем при чтении реакции следует избегать сильного встряхивания пробирок. О-диагностикумы дают мелкозернистую агглютинацию, не разбивающуюся при встряхивании.

Используется также Vi-диагностикум, позволяющий обнаружить Vi-антитела в сыворотках больных брюш­ным тифом и бактерионосителей.

Он представляет собой взвесь брюшнотифозных па­лочек, обезвреженных формалином (0,4 %). Для полу­чения препарата рекомендуются штаммы в V-форме, типичные по всем признакам и не имеющие жгутикового аппарата. Диагностикум содержит 3 млрд. микробных тел в 1 мл взвеси. Специфическая активность его про­веряется в реакции агглютинации с эталонной монорецепторной Vi-сывороткой. Срок годности 1 год.

В ряде случаев для целей серологической диагности­ки применяют не корпускулярные диагностикумы, а выделенные из микробных тел антигены.

Микробная клетка представляет собой сложный глюцидо-липоидно-полипептидныйкомплекс, в который вхо­дят как полноценные антигены, так и гаптены.Изготов­ление полных антигенов проводится по способу Буавена и Мезробеану. Для этой цели берут хорошо изученную чистую культуру определенного вида микробов и про­изводят посев на питательные среды. Через сутки инку­бации при 37 °С смыв культуры дважды промывают (при центрифугировании), физиологическим раствором, затем экстрагируют при низкой температуре десятикратным количеством 1/4 N раствора трихлоруксусной кислоты. Экстракт нейтрализуют углекислой содой до рН 7,0 и диализуют в течение 2 суток в текучей водопроводной воде и в течение 1 суток — в дистиллированнойводе. Диализованный экстракт осаждают четырьмя объема­ми ацетона, растворяют в дистиллированной воде и вторично осаждают ацетоном. Полученный осадок пол­ного антигена промывают спиртом и эфиром, высушивают ихранят в виде сухого порошка.

Антигены из микробных клеток извлекают и другими способами: многократным замораживаниемс последую­щим оттаиванием, кипячением, действием ультразвука, спирта, соляной кислоты и др.

Бактерийные антигены применяются в реакциях преципитации, пассивной гемагглютинациис диагности­ческими целями идля изучения антигенного аппарата микробов иих типизации.

В настоящее время разработаны методы приготов­ления эритроцитарных диагностикумовс длительным сроком годности. Действующим началом их являются извлеченные из тех или иных микроорганизмов анти­гены, которыми сенсибилизированы эритроциты.

Принцип приготовления эритроцитарныхдиагности­кумов сводится к следующему: дефибринированная кровь человека О (1) группы или барана фильтруется через марлю и трижды отмывается на центрифуге ох­лажденным физиологическим раствором. После этого производится обработка эритроцитов формалином. Го­товят взвесь, содержащую 12,5 %эритроцитов, в нее помещают целофановый мешок с формалином и встря­хивают на шюттель-аппаратев течение 16 часов. В пер­вые 2 часа формалин поступает через поры целофана, затем его прокалывают и, наконец, разрывают. Этот прием позволяет получить медленное вначале и посте­пенноусиливающееся действие формалина на эритро­циты. По окончании срока встряхивания эритроциты вновь фильтруют через марлю, отмывают 6 раз десяти­кратным объемом охлажденного до 4-5 °С физиологического раствора на центрифуге при 2500—3000 об/мин,соединяют с равным объемом стерильного нейтрально­го физиологического раствора иразливают во флаконы. В таком виде формалинизированные эритроциты можно хранить до года. В дальнейшем, в зависимости от ха­рактера антигена, эти эритроциты либо обрабатывают дополнительно таннином,либо соединяют с антигеном без этой обработки.

Так, для приготовления дифтерийного истолбнячно­го эритроцитарных диагностикумов, формалинизирован­ные эритроциты отмывают один раз физиологическим раствором(рН 7,2), разводят их до 2,5 % концентрации, добавляют равный объем таннина в разведении 1:20000, взбалтывают и выдерживают 15 минут при комнатной температуре. Затем эритроциты отмывают 3 раза пятью-шестью объемамифизиологического раствора (рН 7,2). Проверяют на отсутствие спонтанной агглютинации, готовят 2,5 % взвесь, к которой прибавляют очищенные, концентрированные анатоксины — дифтерийный(10—20 Lfна один миллилитр взвеси) или столбнячный (5—10 ЕС на один миллилитр взвеси).

Смесь выдерживают при 37 °С — 3 часа. За один час до окончания инкубации добавляют 1 % формалина, встряхивают жидкость до образования равномерной взвеси. После этого срока эритроциты снова отмывают три раза нейтральным физиологическим раствором, со­держащим 1 % формалина. Отмытые сенсибилизирован­ные эритроциты разводят фосфатно-буферным раство­ром (рН 7,0) с формалином (1 %) так, чтобы в 0,05 мл взвеси содержалось 6—8 млн. эритроцитов (подсчет в камере Горяева). В препарате проверяют густоту взве­си, отсутствие спонтанной агглютинации, специфическую активность с соответствующими иммунными сыворотка­ми. Для контроля применяют эритроциты, обработанные таким же способом только не сенсибилизированные антигеном.

Срок годности столбнячного и дифтерийного эритро­цитарных диагностикумов — 6 месяцев.

При изготовлении туляремийного эритроцитарногодиагностикума формалинизированные эритроциты сен­сибилизируют антигеном, полученным по методу Буавена и Мезробеану из высушенных туляремийных бактерий.

Для постановки реакции употребляют 2,5 % взвесьсенсибилизированных эритроцитов. Активность препарата проверяют в реакции непрямой гемагтлютинация с агглютинирующей противотуляремийной сыво­роткой. Если сенсибилизированные эритроциты агглю­тинируются этой сывороткой в разведении ее меньшем, чем предусмотрено инструкцией — эритроцитарный диагностикумбракуется.

Срок годности препарата — 9 месяцев.

Эритроцитарный Ви-диагностикумпредставляет собой формалинизированные эритроциты человека 0 (1) группы, сенсибилизированные очищенным Ви-антигеном брюшнотифозных бактерий, в фосфатно-буферном фи­зиологическом растворе. Препарат стандартизируют таким образом, чтобы 1 мл взвеси содержал 50 млн. эритроцитов. Специфическая активность эритроцитарного Ви-диагностикума определяется в РНГА с одной адсорбированнойбрюшнотифозной Ви-сывороткой и пятью сыворотками людей, привитых против брюшного гифа. Препарат годен в течение шести месяцев.

Риккетсиозные диагностикумы

Для дифференциальной диагностики риккетсиозов серологическим методом в постановке реакций связыва­ния комплемента и агглютинации широко применяются цельные риккетсиозные антигены. Для приготовления диагностикумов из риккетсий могут быть использованы ку­риные эмбрионы, белые мыши, платяные вши.

Для заражения куриных эмбрионов используются штаммы риккетсий Провачека, Музера и Бернета.

Риккетсии культивируют в желточном мешке эмбрио­на. После размножения риккетсий желточныемешки, из­влеченные стерильными пинцетами из вскрытых яиц, помещают в стерильные банки со стеклянными бусами (5-10 желточных мешков в банку) иизмельчают путем тщательного встряхивания. К полученной массе добав­ляется физиологический раствор из расчета 10 мл на 1 желточный мешок. Все вновь тщательно встряхивается для лучшего измельчения тканей, и затем, в каждую банку добавляется еще 100 мл физиологического раство­ра, содержащего формалин в количестве от 0,8 (для культур риккетсий Провачека и Музера) до 1 % (для риккетсий Бернета) и 10 % фосфатного буфера с рН 7,0. После встряхивания банки помещаются в рефрижератор и хранятся там до истечения срока обезвреживания.

В дальнейшем полученная указанным способом пер­вичная взвесь риккетсиозного материала сводится в бу­тыли соответствующей емкости (по 100 желточных мешков).

Дальнейшая обработка первичной взвеси риккетсий Провачека и Музера производится не ранее 48 часов пребывания риккетсиозного материала в формалинизированном физиологическом растворе, а риккетсий Бер­нета только после 15 дней пребывания в этих же условиях.

Обработка первичной взвеси производится методом сепарирования или центрифугирования в комбинации с эфирной обработкой. Осадок после третьего сепариро­вания состоит обычно из чистых риккетсий. Сепариро­ванием и эфирной обработкой достигается отделение риккетсий от тканевых примесей.

Риккетсиозная взвесь стандартизуется по оптическо­му бактерийному стандарту и доводится путем разведе­ния стерильным физиологическим раствором с 5 % саха­розы до концентрации, соответствующей мутности 2 млрд. микробных тел в 1 мл. Стандартизованная взвесь разливается в ампулы по 0,5 мл, замораживается при t -20°… -25° и высушивается в вакууме.Риккетсиозный антиген подвергается контролю на раствори­мость, правильность стандарта, ставятся реакции агглю­тинации и связывания комплемента с типовой иммунной сывороткой, проводится микроскопический контроль на отсутствие бактериального загрязнения. Сухой антиген хранится при температуре +4°… +10°. Он годен в тече­ние 2,5 лет.

Для серологической диагностики некоторых риккет­сиозов, например, исторического сыпного тифа, приме­няется антиген из риккетсий, культивированных в ки­шечниках вшей.

Для изготовления антигена используется несколько штаммов риккетсий Провачека, выделенных от больных сыпным тифом. Этими штаммами заражают с помощью микроклизмы взрослых, здоровых платяных вшей. До момента гибели их кормят один раз в день на донорах, перенесших сыпной тиф или привитых.

Зараженные вши погибают в сроки от четвертого до восьмого дня. После гибели их помещают в 0,5 % фенол, через 2—3 дня вскрывают, отсепарировают ки­шечники, растирают их в ступке с физиологическим раствором, содержащим 0,5 % фенола, затем взвесь центрифугируется или оставляется для осаждения круп­ных частиц.

Антиген представляет собой взвесь в физиологиче­ском растворе убитых фенолом риккетсий Провачека, культивированных в кишечниках зараженных вшей. Он содержит в 1 мл 3—5 млрд. риккетсий (50—60 кишечни­ков зараженных вшей).

Для предупреждения порчи от замерзания во время транспортировки в некоторые серии добавляют 10 % глицерина; это не отражается на специфической актив­ности препарата, но делает его более морозоустойчивым. Готовый антиген проверяют на агглютинабильность сыворотками сыпнотифозных больных или типовыми иммунными сыворотками и сыворотками здоровых лю­дей. Готовый антиген испытывается на специфическую стерильность путем внутрибрюшинного введения 2 мл взвеси осадка антигена морским свинкам или вшам по методу Вейгля. У свинок ежедневно измеряют температуру. Если у них не отмечается повышения температу­ры, антиген считается специфически стерильным. При заражении вшей микроскопическое исследование маз­ков из кишечников проводится с 6-го по 10-й день, в мазках не должны обнаруживаться риккетсии.

Готовый диагностикум разливается в ампулы по 1,5 или 10 мл. Срок годности равен 1 году. Препарат про­ходит контроль на стерильность, соответствие стандарту и агглютинабильность.

Применяется в реакции макроагглютинации. Харак­тер агглютинации риккетсий мелкозернистый. Реакция высокоспецифична. Положительный результат 1:40 + + + + считается диагностическим титром.

В разведенном виде препарат можно применять для реакции связывания комплемента.

Помимо вышеперечисленных антигенов для диагно­стики эпидемического сыпного тифа и крысиного риккетсиоза применяется антиген, приготовленный из лег­ких белых мышей, зараженных риккетсиями Провачека и Музера.

Богатые риккетсиями мышиные легкие размельча­ются в ступке с кварцевым песком и разводятся формалинизированным физиологическим раствором из расчета 3—4 мл на легкое.

Далее формалинизированная взвесь центрифугирует­ся дважды: один раз при 1500 оборотах в минуту для удаления тканевых примесей, другой раз при 3000 обо­ротах в минуту для получения риккетсий в осадке. Оса­док обрабатывается физиологическим раствором, содер­жащим 0,4 % формалина и 0,5 % фенола.

В дальнейшем он подвергается обработке эфиром, после чего к нему добавляется сахароза и производится высушивание из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума.

Готовый препарат представляет собой сухой антиген из хорошо очищенных убитых формалином риккетсий, подвергнутый контролю по вышеописанной методике.

Вирусные диагностикумы – антигены

Вирусные диагностикумы представляют собой анти­гены, используемые для серологических реакций. В за­висимости от цели применения их подразделяют на анти­гены для реакции связывания комплемента и антигены для реакции торможения гемагглютинации.

Для изготовления диагностикумов из разных вирусов используются преимущественно следующие инфициро­ванные материалы: для вируса гриппа — аллантоисная жидкость, для эпидемического паротита — амниотическая или аллантоисная жидкость, для орнитозов и лимфогранулемы — желточные мешки куриных эмбрионов, для вирусов энцефалитов — мозговая ткань мышей, ку­риных эмбрионов или культура тканей, для аденовиру­сов и полиомиелита — культуральные жидкости. Диаг­ностикумы из аллантоисной и амниотической жидкости употребляют в нативном виде, другие — требуют специальной сложной обработки, так как обладают антикомплементарными свойствами.

Методы обработки антигенов делятся на физические и физико-химические. Из физических методов наиболь­шее применение имеет метод повторного замораживания и оттаивания, т. е. термолизис. Из физико-химических методов — обработка эфиром и хлороформом.

Метод термолизиса заключается в следующем: гото­вится 10 % суспензия на физиологическом растворе из инфицированной ткани, куда добавляется 2 % инактивированной сыворотки морской свинки. После 18—20-ча­сового экстрагирования при 4 °С крупные тканевые части­цы удаляют путем центрифугирования в течение 30 минут при 2500 оборотах. Надосадочная жидкость подвергается пятикратному замораживанию (при —7 °С) и оттаиванию (при +7 °С). Затем жидкость центрифуги­руют в течение часа при 3500 оборотах в минуту. При­готовленный таким образом диагностикум представляет собой слегка опалесцирующую жидкость.

Обработка вирусных диагностикумов физико-хими­ческим методом заключается в том, что готовят суспен­зию, как описано выше для термолизиса, к ней добавля­ют полуторный объем эфира или хлороформа и в тече­ние 2 часов производят встряхивание. Материал помещают на 18 часов в холодильник при 4 °С. Затем центрифугируют в течение 30 минут при 3000 оборотах в минуту. Происходит расслоение суспензии. В случае обработки эфиром антиген будет в нижнем слое, а при обработке хлороформом — в верхнем. Готовый антиген по внешнему виду представляет прозрачную жидкость. Вирусные диагностикумы не должны содержать жи­вых вирусов. Инактивирование их производится либо прогреванием (37 °С), либо действием химических веще­ств (формалин, бетапропиолактон).

Существует значительное количество модификаций приготовления антигенов применительно к тому или ино­му вирусу. Выпускаются вирусные, антигены для диаг­ностики следующих заболеваний: японского и клещево­го энцефалита, лимфоцитарного хориоменингита, орнитозов, гриппа и эпидемического паротита, венесуэльского энцефаломиелита, западного энцефаломиелита лошадей, аденовирусных инфекций и др.

При многих инфекционных заболеваниях изменяется реактивность организма к возбудителю инфекции или его продуктам. Такая измененная реактивность организ­ма называется инфекционной аллергией.

Поиск по сайту: