ГЛАВА 8. БАКТЕРИОФАГИ

Бактериофаг - ультрамикроскопический, внутрикле­точный паразит - вирус, лизирующий бактерии и актиномицеты.

Впервые явление бактериофагии наблюдал в 1898 г. Н Ф. Гамалея, позднее - Туорт в 1915 г. и д'Эрелль в 1917 г.

Бактериофаг обладает всеми основными свойствами, присущими вирусам, а именно: 1) имеет элементарные частицы величиною в пределах от 20 до 200 нм,

2) со­держит в своем составе нуклеиновую кислоту и белок,

3) не растет на искусственных питательных средах, раз­множаясь только внутри клеток микробов,

4) обладает высокой специфичностью в отношении поражаемой клет­ки,

5) имеет антигенную обособленность от клетки хо­зяина.

Бактериофагу присуща наследственность, изменчи­вость, приспособляемость и другие свойства вирусов. Корпускулы бактериофагов имеют форму сперматозои­дов или головастиков и состоят из сферической, цилинд­рической или многогранной головки и короткого или длинного прямого или изогнутого отростка.

Фаговая частица состоит из белковой оболочки и внутреннего содержимого, в основном представляющего собой фибриллы дезоксирибонуклеиновой кислоты. В от­ростке фаговой корпускулы имеется центрально распо­ложенный стерженек белковой природы. На конце отро­сток имеет утолщение в виде пластинки, от которого отходят белковые нити диаметром не более 2 миллимик­ронов.

В настоящее время описаны бактериофаги различных аэробных и анаэробных патогенных и сапрофитных бак­терий (кокков, палочек, вибрионов, бацилл, микобактерий) и актиномицетов.

Бактериофаг вступает в определенное взаимодейст­вие с микробной клеткой. Это взаимодействие, называе­мое литическим циклом, включает следующие этапы:

1) адсорбция фаговых частиц на поверхности бактерий;

2) внедрение активного фагового материала внутрь клетки;

3) внутриклеточное размножение бактериофа­га;

4) разрыв клеточной оболочки и выход новообразо­ванного бактериофага во внешнюю среду.

Распространение бактериофага

Бактериофаги широко распространены в природе. Почти везде, где условия обитания благоприятны для размножения бактерий и актиномицетов, удается обна­ружить паразитирующие в их клетках бактериофаги. Их можно выделить из открытых полостей организма чело­века и животных, различных водоемов, сточных вод, из влажной, унавоженной почвы, из соответствующих культур бактерий и актиномицетов. Много бактериофа­гов находится в выделениях больных людей и животных, особенно в период выздоровления от инфекционных за­болеваний. Так, бактериофаги против возбудителей брюшного тифа, паратифов А и Б, дизентерии, холеры можно выделить из испражнений, против гноеродных кокков — из гнойного отделяемого ран и воспалительных очагов, против туберкулезной палочки — из мокроты и т. д.

Большую роль в распространении и сохранении бак­териофагов в природе играют так называемые лизогенные бактерии и актиномицеты, постоянно выделяющие бактериофаги во внешнюю среду.

Для выделения бактериофага исследуемый материал (воду, испражнения, гноя, почву и др.) засевают в жид­кую питательную среду, наиболее благоприятную для развития тех микроорганизмов, против которых ищут бактериофаг. Среду оставляют в термостате на 18-20 часов. Иногда производят предварительное обогаще­ние среды чистой культурой соответствующего микроба, заведомо нелизогенного, т. е. не выделяющего бактерио­фаг. Помутневшую питательную среду пропускают через бумажный, а затем через бактериальный фильтр, асбестовые пластины, керамические свечи. Полученный фильтрат испытывают на присутствие бактериофага пу­тем засева совместно с соответствующей микробной культурой на плотные (методом стекающей капли - проба Отто) или жидкие питательные среды. При на­личии бактериофага после 18-часовой инкубации на по­верхности агара, обнаруживается сплошной налет культуры, а па месте растекающейся, капли, в зависимо­сти от содержания частиц бактериофага в фильтрате, бактериальный рост полностью отсутствует или наблю­даются округлые «стерильные пятна» — колонии бакте­риофага. На жидкой питательной среде присутствие бактериофага обусловливает просветление культуры.

Для выделения чистой культуры бактериофага мате­риал из развившегося отдельного стерильного пятна пе­реносят бактериологической иглой в суспензию молодой микробной культуры.

Для гарантии чистоты бактериофага операцию выде­ления из изолированного стерильного пятна последовательно повторяют 5—10 раз. Материал из последнего стерильного пятна снова засевают вместе с фагочувствительными микробами на жидкую питательную среду. После 6—18-часовой инкубации культуру фильтруют, проделывают несколько пассажей для увеличения количества бактериофаговых корпускул и получают чистую культуру бактериофага.

Выделенный из внешней среды, бактериофаг, культи­вируемый в лабораторных условиях на соответствующей культуре бактерий, называется маточным штаммом соответствующего бактериофага.

Практическое значение бактериофага

В настоящее время выпускаются и применяются следующие виды бактериофагов: коли жидкий, коли-протейный жидкий и протейный жидкий бактериофаги, бактериофаг брюшнотифозный поливалентный (жидкий и сухой), диагностический брюшнотифозный бактериофаг, дизентерийный поливалентный лечебный (сухой) и диагностический бактериофаг, холерный бактериофаг, стафилококковые антифагин и диагностические типовые бактериофаги и стрептококковый жидкий бактериофаг

Бактериофаг широко применяется для диагностики, профилактики и лечения ряда инфекционных заболева­ний бактериальной этиологии — дизентерии, брюшного тифа, холеры, чумы, геморрагической септицемии, стафилококковых, стрептококковых и анаэробных инфекций и др. В связи с его высокой специфичностью он приме­няется также как диагностический препарат для идентификации бактериальных культур в медицинской, вете­ринарной, технической микробиологии и фитопатологии.

Метод фаготипажа, основанный на исключительной специфич­ности определенных штаммов бактериофага, позволил распределить на фаготипы ряд штаммов бактерий, кото­рые неотличимы друг от друга по другим признакам. Фаготипаж с успехом применяется при идентификации бактерий брюшного тифа, сальмонелл, стафилококков и ряда других бактерий. Этот метод дает возможность эпидемиологу точно проследить за цепочкой заразных заболеваний и определить источник инфекции (бацил­лоноситель, больной). Известное диагностическое значе­ние для клиники имеет выделение бактериофага из ис­пражнений больного при некоторых кишечных инфекциях, в особенности при дизентерии.

Важное значение имеет бактериофаг для быстрого обнаружения очень небольших количеств патогенных бактерий во внешней среде путем определения нарастания титра специфического бактериофага.

Бактериофаг применяется и для борьбы с бактери­альными вредителями различных технических брожений и в производстве ферментов, продуцируемых бактери­альными культурами. В то же время бактериофаг, зара­жая культуры микробов, является опасным вредителем денных производственных штаммов микроорганизмов (вакцинных, возбудителей молочнокислого, ацетонобутилового и некоторых других брожений, продуцентов анти­биотиков), вызывая серьезные нарушения технологиче­ского процесса.

Бактериофаг — один из наиболее мощных факторов изменчивости бактерий и актиномицетов. Он играет оп­ределенную роль в самоочищении воды и почвы.

Технология производства и контроль бактериофагов

В производственных условиях для изготовления пре­парата бактериофага применяются только апробирован­ные штаммы бактериофагов и культуры соответствующих микробов, обладающих типичными морфологиче­скими, биохимическими и серологическими свойствами. Штаммы бактериофагов должны быть музейными и ра­бочими. На производстве они часто называются маточ­ными бактериофагами. Музейные производственные штаммы бактериофагов ежегодно обновляются путем выделения новых или пассажами имеющихся штаммов бактериофага через организм больного, а также адап­тацией к свежевыделенным, резистентным к данному бактериофагу культурам. Маточный бактериофаг дол­жен размножаться и пассироваться только на соответст­вующей культуре в жидкой питательной среде, напри­мер, брюшнотифозный бактериофаг пассируется на культуре брюшнотифозной палочки в бульоне Мартена.

Рабочий маточный бактериофаг готовится из очеред­ной серии музейного штамма бактериофага, отдельно на каждом из производственных штаммов микробов.

Препарат бактериофага представляет собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом. Он содержит большое количество размножившихся фагов, обладающих специфическими лизирующими свойствами.

Получение бактериофага в настоящее время осуще­ствляется в специальных аппаратах — реакторах, емко­стью от 250 до 1000 л, с применением аэрации как фактора, стимулирующего развитие микроорганизмов. Для производства бактериофага берется его рабочая маточная раса и соответствующие культуры микробов. В реак­тор наливается жидкая питательная среда, например, бульон Мартена или Хоттингера для изготовления брюшнотифозного и дизентерийного бактериофагов с рН 7,4—7,6 и стерилизуется при температуре 110 °С в течение 40 минут. После стерилизации среда охлаж­дается до 39 °С и засеивается соответствующей микроб­ной культурой и маточным бактериофагом одновременно. Для засева употребляются 18-часовые агаровые культу­ры, которые прибавляются из расчета 50 млн. микробных телна 1 мл среды. Бактериофаг добавляется в количе­стве не более 0,3 % по отношению к объему питательной среды. Среду с засеянными в ней культурой и бактерио­фагом оставляют при температуре 37 °С на 6—18 часов. Бактериофаги активно размножаются внутри бактери­альных клеток, увеличиваясь в количестве и вызывая их лизис, что внешне проявляется полным просветлени­ем среды. К полученному лизату добавляется в качестве консерванта хинозол (0,01 %) или фенол (0,25 %) и не позже чем через 2 часа после этого содержимое реакто­ра фильтруется через бактериальные фильтры (асбесто­вые пластины, свечи Шамбеолена или свечи ГИКИ соответствующей пористости) для удаления оставшихся микробных клеток.

Полученный препарат-бактериофаг должен иметь вид, совершенно прозрачной жидкости желтого цвета боль­шей или меньшей интенсивности. Он проходит контроль на стерильность, безвредность и литическую активность, т. е. вирулентность.

Стерильность бактериофага проверяют обычным спо­собом.

Безвредность препарата проверяют путем введения животным, например, брюшнотифозный и дизентерийный бактериофаги вводят подкожно трем мышам по 1 мл, либо внутривенно одному кролику 5 мл. Наблюдение за животными ведется в течение 3—4 суток; если препарат безвреден, они должны оставаться бодрыми и здоровыми.

Литическая активность бактериофага, его вирулент­ность определяются методом титрования на жидкой и плотной пи­тательной среде.

Определение вирулентности методом Аппельмана прово­дится по следующей схеме: набирается ряд пробирок, содержащих по 4,5 мл мясо-пептонного бульона; в пер­вую из них добавляется бактериофаг в количестве 0,5 мл, тщательно перемешивается другой пипеткой и в количе­стве 0,5 мл переносится в следующую пробирку, из второй — 0,5 мл в третью и т. д. В серии пробирок бактериофаг разводится 1:10; 1:100; 1:1000 и т. д. Во все пробирки, включая и контрольную, содержащую только 4,5 мл бульона, вносят по 250 млн микробных тел суточной культуры соответствующих бактерий, затем ставят их на 18—20 часов в термостат, после чего учитывают результат. Степень лизиса отмечается плюсами следую­щим образом: четыре плюса (++++) - абсолютная прозрачность среды, равная стерильному бульону; три плюса (+++) - почти полная прозрачность, лишь не­значительно отличающаяся от стерильного бульона; два плюса (++) - муть, значительная по сравнению состерильным бульоном, но незначительная по сравнению с контрольной пробиркой; один плюс (+) - явная муть, но все же более слабая, чем в контрольной пробирке, минус (-) - муть, как в контрольной пробирке.

Определение вирулентности на плотной питательной среде методом Отто заключается в следующем: на оп­ределенные сегменты агаровых пластинок в бактерио­логических чашках, хорошо подсушенных в термостате и предварительно засеянных сплошным газоном соответ­ствующей культуры, наносится по одной капле иссле­дуемого бактериофага определенного разведения, соот­ветствующего разведению в аппельмановском ряду. Кап­ли подсушиваются и чашки помещаются в термостат на 18—20 часов. Результат учитывается по степени ли­зиса и обозначается плюсами: четыре плюса (++++) - полный лизис; на месте закапывания бактериофага культура не растет; три плюса (+++) - лизис с наличием единичных колоний культуры; два плюса (++) - лизис в виде сливных участков с ост­ровками роста культуры; один плюс (+) - лизис в виде отдельных стерильных пятен на сплошном газоне куль­туры; минус (-) - сплошной рост культуры, не обнару­живается ни одного стерильного пятна.

За титр бактериофага при определении методом Аппельмана принимают то наибольшее разведение его, которое вызывает полное растворение соответствующих микробов. Бактериофаги выпускают, с определенными титрами, не ниже установленных, по инструкции. Так, титр брюшнотифозного бактериофага со всеми штамма­ми, входящими в титрование, должен быть не ниже 10^-7 для штаммов, находящихся в Vi-форме, и не ниже 10^-6 для штаммов, находящихся в 0-форме.

После проведения контролей бактериофаг разливает­ся во флаконы нейтрального стекла (по 25, 50 и 100 мл), которые должны быть укупорены резиновой пробкой со­ответствующего размера и залиты смолкой.

Условия хранения бактериофага такие же, как и дру­гих препаратов.

Срок годности брюшнотифозного, холерного; гангре­нозного, стафилококкового и стрептококкового бактерио­фагов - один год, а дизентерийного - два года.

Помимо жидких препаратов бактериофага могут изготавливаться также сухие. Для получения их, дейст­вующее начало жидкого фаголизата осаждается серно­кислым аммонием. Выпавший осадок отделяется от жид­кой части, к сырой массе добавляется в качестве ста­билизатора глюконат кальция (9 %), смесь тщательно растирается, замораживается при – 30 °С и высушивается под вакуумом.

Выпускается сухой фаг в виде таблеток, которые содержат стабилизированную субстанцию фаголизата, обычно применяемую таблеточную смесь (глюкозу, глюконат кальция, тальк, стеарин) и покрыты защитной кислотоустойчивой оболочкой из ацетилцеллюлозы. Одна таблетка cyxогo бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого.

В отношении стерильности и безвредности к сухим бактериофагам предъявляются те же требования, что и к жидким. Титр сухих бактериофагов устанавливается в соответствии с их лизирующей активностью, по отно­шению к разным видам и типам микробов.

Применяются они в тех же случаях, что и жидкие бактериофаги. Срок годности сухих фагов — 1 год.

Поиск по сайту: