ГЛАВА 13. КОНТРОЛЬ ПРЕПАРАТОВ

При выпуске микробных препаратов необходим самый тщательный контроль их на всех этапах произ­водства как для определения их полезных качеств, так и для выявления наличия и степени нежелательного воз­действия так называемой реактогенности, способности вызывать тяжелые реакции в организме прививаемого в ответ на введение препарата. Повышенная реактогенность препаратов в условиях массового их применения может свести на нет все их полезные свойства. Как бы ни был специфически хорош препарат, он не может быть применен для людей, если он не безвреден.

Производство микробных препаратов находится под многоступенчатым контролем. Основной контроль — это контроль в производственных лабораториях. Здесь в процессе повседневной работы осуществляется разнообразная проверка, в том числе главным образом про­верка стерильности после каждой, даже самой незначи­тельной, манипуляции с препаратом.

Вся деятельность производственного отдела находится под повседневным наблюдением отдела биологического контроля (ОБК). Это общепроизводственная лаборато­рия, задачей которой является наблюдение за точностью выполнения технологического процесса на определенных этапах производства. Препарат контролируется в ОБК иногда после производственного контроля, иногда параллельно или совместно с ним. ОБК выдает разрешение на выпуск и контрольный номер серии препарата.

Всю работу по контролю производства в широком аспекте возглавляет Государственный контрольный ин­ститут медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (ГКИ). Он осуществляет контроль несколькими путями. С одной стороны, в ГКИ непосред­ственно проверяются образцы препаратов, выборочно направляемых туда производством. Иногда в течение определенного промежутка времени ГК контролирует каждую серию препарата. Это бывает в тех случаях, когда какой-либо препарат впервые вводится в произ­водство вообще или в данном институте. ГКИ выступает в качестве арбитра в тех случаях, когда возникают разногласия в оценке качества препарата между произ­водственными лабораториями и ОБК, и, наконец, он изучает препараты, на которые, поступают рекламации. ГКИ проводит большую работу по апробированию но­вых препаратов, по разработке различных стандартов, которыми пользуются производственные институты при оценке выпускаемых ими препаратов.

Обычно не реже одного раза в год ГКИ направляет в производственные институты бригады специалистов, которые проводят глубокую, всестороннюю проверку производственной деятельности института.

Основным стремлением каждой производственной лаборатории является проведение контроля таким об­разом, чтобы все неполадки с препаратом, если они есть, были выявлены внутри производства, до выпуска потребителю, и причины их устранены без вмешатель­ства высших контролирующих организаций.

Проверка стерильности препаратов. Стерильность проверяется посевом препаратов на пита­тельные среды, набор которых и питательные свойства обеспечивают возможность выявления разных предста­вителей бактерий как специфических, из которых, на­пример, приготовлены вакцины, так и посторонних, могущих попасть в препарат при нарушении правил асептики в процессе производства. Обычно для провер­ки стерильности используются следующие питательные среды: скошенный агар, мясо-пептонный бульон (МПБ)

с 0,5 % глюкозы, МПБ + 0,1 % агара и кусочки мяса. Для контроля препаратов, содержащих в качестве кон­серванта мертиолят, применяются среды с тиогликолатом натрия. Посевы выдерживают при 37 °С в течение 8 суток. Выявление сапрофитной флоры и плесеней производится путем посева на среду Сабуро и в МПБ. Посевы выдерживаются в течение 8 дней при темпера­туре 20—22 °С. В случае пророста изучают мазки из посе­вов и повторно засевают препарат. Если при этом снова вырастают те же микробы, что и в первый раз, препа­рат бракуют. Если же единичные пробирки прорастают иными микробами, производят посев третий раз. При наличии пророста препарат бракуют. Если обсемененность сыворотки, анатоксина или бактериофага выяв­ляется только посевом, то препараты могут быть профильтрованы через бактериальные фильтры; при наличии видимого пророста препараты бракуются. Не подлежат переработке и бракуются обсемененные вакцины.

В тех случаях, когда вакцина из инактивированных вирусов или риккетсий, специфическая стерильность (отсутствие жизнеспособных, неинактивированных ви­русов, риккетсий) может быть установлена лишь в опы­тах на чувствительных животных, куриных эмбрионах или культурах тканей.

Проверка безвредности препаратов. Безвредность препаратов определяется па чувстви­тельных животных. Чаще всего для этих целей исполь­зуются морские свинки, белые мыши. Для определения безвредности сывороток их вводят подкожно морским свинкам (по 5 мл подогретого до 37 °С препарата в оба бока). Срок наблюдения 5—7 дней. Сыворотка при­знается безвредной, если в течение сроков наблюдения животные не погибают и у них не развиваются общие и местные реакции. Аналогичным образом проверяется безвредность анатоксинов с той только разницей, что свинке вводят 5 мл препарата и наблюдение ведут более долго (21—30 дней) для выявления поздних реакций за счет оставшихся недообезвреженными малых коли­честв токсинов.

Безвредность вакцин определяется на белых мышах, которым препарат в дозе 0,5 мл вводится подкожно. Срок наблюдения 3—5 дней; в течение этого времени мыши должны быть живы и здоровы.

Если препараты содержат консервант фенол, прово­дится определение избытка его на белых мышах. При избытке консерванта у животных появляются явления отравления (резкая дрожь или гибель животного).

Помере того, как в производстве вирусных препа­ратов все большее значение стали приобретать культу­ры тканей, сделался более совершенным контроль безопасности инактивированных вирусных препаратов, направленный на выявление оставшихся жизнеспособ­ными вирусов.

До последнего времени единственной возможностью осуществления такого контроля была постановка биологической пробы, т. е. введение препарата чувстви­тельным животнымс последующими «слепыми» пасса­жами, ведущими к накоплению вируса в тканях. Однако это не всегда гарантировало выявление малых коли­честв вирусов, вирулентность которых к тому же могла быть снижена в процессе инактивирования. Из истории специфической профилактики известны примеры того, как «инактивированные» вирусные вакцины содержали жизнеспособный вирус и применение их привело к воз­никновению заболеваний (полиомиелитная вакцина Солка — США). Сейчас вакцина, подлежащая проверке, засевается на культуру ткани, где происходит размно­жение вируса в том случае, если он остался жизнеспо­собным. Обогащенная вирусом культуральная жидкость вводится чувствительным животным. Это дает возможность с большей достоверностью обнаружить вирус в «инактивированном» препарате.

Необходимо обратить внимание еще на один вид контроля вакцин. Это проверка переносимости на лю­дях. С этой целью препарат, прошедший все виды контроля, вводится небольшому числу лиц, подлежащих прививкам с последующим тщательным наблюдением за наступающей у них реакцией. Разрешение на выпуск вакцины дается только в том случае, если она не вы­зывает повышенных реакций. Помимо этой проверки, уже непосредственно перед организацией массовых при­вивок, вакцина вводится небольшому числу лиц (10—25) из коллективов, подлежащих прививкам. Массовая вакцинация начинается не ранее того, как будет учтена реакция у предварительно иммунизированных лиц. При наличии повышенной реактогенности вакцина выдерживается в течение двух месяцев, после чего снова про­веряется. Если и теперь обнаруживается повышенная реактогенность вакцины, серия бракуется.

Определение пирогенности сывороток. В процессе очистки и концентрации сыворотка под­вергается воздействию различных химических веществ, процессы обработки не могут проводиться в стерильных условиях, следовательно, есть возможность попадания в препарат микроорганизмов и накопления продуктов их жизнедеятельности. Все это приводит к тому, что не­которые серии очищенных сывороток приобретают так называемую пирогенность — способность вызывать повы­шение температуры при введении человеку и животным. Во избежание этого осложнения вес выпускаемые серии очищенных сывороток подвергаются специальному контролю.

Опыт ставится на 3 кроликах весом в 1—1,5 кило­грамма. Исследуемую сыворотку, подогретую до 37 °С, вводят внутривенно из расчета 1 мл на килограмм веса животного. До введения сыворотки и спустя 1, 2 и 3 часа после введения у кроликов измеряется температу­ра. Если хотя бы у одного из трех животных темпера­тура повышается на 0,8° и выше, опыт повторяется еще на трех кроликах. Сыворотки признаются пирогенными и выпуску без дополнительной обработки не подлежат, если после повторного исследования из шести кроликов три, либо больше, дадут повышение температуры на 0,8 °С и выше.

Определение иммуногенности вакцин и анатоксинов. Одним из наиболее важных свойств вакцин и анатоксинов является их иммуногенность. Ме­тоды определения ее различны.

В принципе определение иммуногенности препаратов осуществляется следующим образом: животных, облада­ющих чувствительностью к микробам, или токсинам, из которых приготовлены вакцины или анатоксины, имму­низируют этими препаратами по специальным схемам. Через определенные промежутки времени иммунным и контрольным животным вводят установленное количе­ство культуры (в DCL) или токсина (в DLM) и наблю­дают за ними в течение тех или иных сроков. При ги­бели контрольных животных иммунизированные должны оказаться устойчивыми и остаться живыми и здо­ровыми.

Анатоксины, помимо иммуногенности, изучаются в от­ношении их антигенных свойств. Для этого используется реакция флокуляции или реакция связывания антиток­сина со стандартными сыворотками: оценка анатоксинов производится в первом случае антигенными единицами (АЕ) и единицами связывания (ЕС) — во втором. Едини­цей связывания анатоксина считается то наименьшее его количество, которое связывает одну антитоксическую единицу соответствующей сыворотки.

Принцип определения антитоксинсвязывающей спо­собности анатоксинов сводится к следующему: разные количества анатоксина смешиваются с определенным количеством стандартной антитоксической сыворотки; после получасового выдерживания в термостате к сме­сям прибавляют вытитрованную дозу токсина и снова выдерживают в термостате, после чего вводят смесь животным, чувствительным киспользуемому в опыте токсину. В том случае, если анатоксин прочно связыва­ется с сывороткой, токсин остается свободным, и у животного возникают те или иные проявления интоксика­ции,характерные для данного токсина.

Наоборот, если анатоксин не связывается с сыворот­кой, она остается свободной и нейтрализует токсин: у животных в этом случае явления интоксикации отсут­ствуют.

Качество анатоксина тем выше, чем меньше количе­ство его, связывающее одну антитоксическую единицу, ичем, следовательно, больше единиц связывания содер­жится в 1 мл препарата. Детали этой реакции здесь, не приводятся, так как они представляют чисто професси­ональный интерес. Для большей объективности в оценке иммуногенности испытуемые, вакцины контролируются одновременно со стандартными препаратами, рассыла­емыми ГКИ. Иммуногенность изучаемого препарата считается достаточной, если она равна или превышает иммуногенность стандартного препарата. При оценке живых вирусных вакцин учитывается такой показатель, как сероконверсия — изменение титра антител в сторо­ну повышения после введения вакцины. Определяется этот показатель путем титрования парных сывороток, полученных до и после вакцинации.

Определение титра сывороток. Актив­ность антитоксических сывороток выражается в анти­токсических единицах. Содержание их в 1 мл называ­ется титром сыворотки.

Для определения титра сыворотки титруют на животных, чувствительных к тому виду токсина, против которого приготовлена испытуемая сыворотка. Так, про­тивостолбнячная, противогангренозные, противоэнцефалитная сыворотки титруются на белых мышах, противо­дифтерийная — на морских свинках.

Токсины, применяемые для титрации сывороток, должны сохраняться в такой форме и при таких условиях, которые обеспечивают максимальную стабильность их свойств. Для этого применяются сухие токсины, токсины, разведенные глицерином, сохраняе­мые при низких температурах.

Титрация разных видов сывороток имеет свои осо­бенности, в принципе же она сводится к определению наибольшего разведения сыворотки, при котором она нейтрализует определенное количество соответствующе­го токсина. Титры противовирусных сывороток опреде­ляются с помощью различных реакций, в зависимости от того, против какого проявления действия того или иного вируса направлены антитела. Так, если вирус обладает гемагглютинирующими свойствами, исполь­зуется реакция торможения гемагглютинации, позволя­ющая определить антигемагглютинирующие свойства иммунных сывороток; если вирус вызывает дегенерацию клеток в культуре ткани, определяется способность сыворотки нейтрализовать это действие; если введение вируса животным приводит к гибели их, испытывается способность сыворотки предупреждать смертельный исход болезни и т. п. Во всех случаях количество виру­са, которое вводится в тот или иной опыт с сывороткой, должно быть тщательно оттитровано. Количество со­державшихся в сыворотках антител устанавливается путем определения максимального разведения их, при котором они нейтрализуют действие определенной дозы вируса. Все ингредиенты, используемые в опытах опре­деления титра антител, должны сохраняться в таких условиях, при которых они в течение более или менее длительного времени не теряют своих свойств. Наиболее отвечает этому требованию хранение в высушенном состоянии при низкой температуре. Определение титра является ответственным разделом процесса изготовле­ния сывороток, требующим большого навыка и тща­тельности в работе. Полученные в опыте данные сравни­ваются с результатами одновременной титрации стандартной сыворотки, рассылаемой контрольным ин­ститутом.

Определение физических свойств пре­паратов. В процессе производства определяется цвет, прозрачность (сыворотки, анатоксины, бактериофаги), степень мутности по оптическим стандартам (вакцины) препаратов. Отклонения от обычных свойств заставля­ют, если это допустимо, производить дополнительную обработку препаратов или браковать их, если необычное свойство нельзя устранить без вреда для основных свойств. Так, не подлежат выпуску мутные сыворотки, гамма-глобулины, нативныеанатоксины, бактериофаги или, наоборот, прозрачные вакцины, сорбированные ана­токсины. Помутнение первой группы препаратов может быть обусловлено проростом их или плохим качеством ампульного стекла. Необычная прозрачность вакцин является следствием процессов автолиза микроорганиз­мов, из которых они приготовлены.

Бракуются препараты, в которых образуются нераз­вивающиесяхлопья. Это может быть следствием не­правильной установки рН разбавителей (физиологический, буферный растворы) в процессе производства или опять-таки связано с выщелачиванием недоброкачест­венного стекла.

Изменения физических свойств препаратов могут наступить при нарушении условий их хранения. Требо­вания к температурному режиму хранилищ для микроб­ных препаратов должны соблюдаться не только в производственных институтах, но и в аптекоуправле­ниях, санэпидстанциях, больницах и врачебных участ­ках, куда эти препараты поступают для применения.

Физические свойства сухих препаратов проверяются по их растворимости, остаточной влажности и форме таблеток. Они должныбыть компактнымии быстро растворяться в разбавителях, прилагаемых к ним.

Контроль живых вирусных вакцин. Вве­дение в производство вирусных вакцин из живых аттенуированных вирусов потребовало разработки дополнительных новых методов контроля, направленных на выявление посторонних агентов, могущих попасть в вакцину из органов итканей животных. В настоящее время существуют вакцины из живых вирусов, для получения которых используются разные субстраты. Так, гриппозная вакцина готовится из штаммов вируса гриппа, выращенных на развивающихся куриных эмбри­онах, полиомиелитная — на первичных культурах ткани почек зеленых мартышек. На этом же субстрате выра­щивается в институте полиомиелита и вирусных энцефалитов штамм вакцинного вируса кори.

Для накоплениявакцинного штамма бешенства предложена клеточная культура почек сирийских хомя­ков. Все эти системы, а также вируссодержащие жид­кости, полученные на них и служащие основой для приготовления живых вакцин, требуют самого тщатель­ного контроля.

Обнаружение цитопатогенных игемадсорбирующих вирусов в культурах тка­ней. Этот вид контроля осуществляется следующим образом: при внесении вируссодёржащей посевной жид­кости в подготовленную для посева культуру ткани некоторое количество матрацев не заражают, но сохра­няют в тех же условиях, что и зараженные, просматри­вая находящуюся вних культуру ткани в течение всего периода их пребывания в термостате для выявления могущих наступить цитопатическихизменений в случае присутствия в ткани постороннего вируса. Помимо этого, в процессе культивирования из этих контрольных матра­цев собирают культуральнуюжидкость, которая засе­вается на первичные культуры различныхклеток. За клетками ведется наблюдение в течение двенадцати дней, и если в них не обнаруживаются цитопатические изменения, то осуществляется еще один пассаж на тех же клеточных системах, что и первый.

Культуры, находящиеся в контрольных матрацах, а также клетки первого и второго пассажей, проверяются на наличие феномена гемадсорбции с эритроцитами человеческими, обезьяньими, морских свинок и кур. Если хотя бы в одном контрольном матраце или пас­сажных культурах обнаруживаются цитопатические из­менения или феномен гемадсорбции,вируссодержащая жидкость, собранная с зараженных матрацев этой се­рии, не может быть использована для приготовления вакцины ибракуется.

Наличие посторонних вирусов в культуре клеток можно определятьпутем титрования вирусов ECHO и риновирусов,засеянных па первичные культуры фибробластов эмбриона человека ина клетки производст­венных культур. Отставание титра тест-вирусов на производственной культуре клеток на 2 и более лога­рифма расценивается как признак заражения их посто­ронними вирусами.. Такая культура не может быть использована в производстве.

В тех случаях, когда необходимо проверить на от­сутствие посторонних вирусов культуральную жидкость, содержащую вирус, который был внесен в культуру ткани (например, вирус полиомиелита), используют специфические сыворотки,содержащие антитела к этому основному вирусу. В предварительных опытах на куль­турах тканей определяется доза сыворотки, полностью нейтрализующая цитопатогенное действие основного вируса.

В опытах с испытуемой вируссодержащей жидкостьюсыворотка применяется в этой дозе. Смесь сыворотки и вируссодержащейжидкости вносится в культуру ткани, за которой ведется наблюдение в течение двух недель. В опытах, направленных наобнаружение посторонних вирусов в тех или иных объектах, используются куль­туры разных тканей различных животных. Если в куль­туре обнаруживаются признаки дегенеративных изме­нений, их относят за счет посторонних вирусов, так как основной вирус нейтрализован сывороткой, и испытуе­мую вируссодержащуюжидкость бракуют.

Если для приготовления вакцины используется вируссодержащая жидкость, полученная от куриных эмбрионов, она должна быть проконтролирована на отсутствие вирусов группы лейкозов птиц. В принципе этот контроль проводится следующим образом: вирус­содержащая жидкость нейтрализуется специфической сывороткой, содержащей антитела против основного вируса. После определенного срока выдерживания, необходимогодля нейтрализации, смесь вносится в культуру ткани, заведомо свободную от вируса лейкоза птиц (из эмбрионов японских перепелок или кур, выращен­ных в безлейкозном хозяйстве). Одновременно такие же культуры ткани заражаются вирусом саркомы Рауса (положительный контроль). Для отрицательного конт­роля оставляют незараженную среду. Все эти среды культивируются в одинаковых условиях, и по истечении двух недель из них готовят путем замораживания и оттаивания антигены для РСК. Реакция ставится с за­ведомо положительными и отрицательными сыворотка­ми, т. е. содержащими и не содержащими антитела к вирусу саркомы Рауса. В тех случаях, когда поло­жительная сыворотка реагирует с испытуемым анти­геном иантигеном из культуры ткани, зараженной вирусом саркомы Рауса (при отрицательных контролях), изучаемая вируссодержащая жидкость не мо­жет быть использована для приготовления вакцины и бракуется.

Посторонние агенты обнаруживаются не только в опытах с культурами тканей. Для этих целей исполь­зуются также опыты на зараженных животных разных видов и разного возраста. Исследуемый материал вво­дится разными путями внутрикожно, подкожно, внутри­венно, в мозг (головкой, спинной), внутрибрюшинно, внутримышечно и т. л. Эти опыты преследуют цель обнаружить вирусы, патогенные для тех или иных жи­вотных.

Выявление вируса лимфоцитарного хориоменингита. В опыте используются белые мыши, которым исследуемый материал вводится в мозг по 0,03 мл и внутрибрюшинно по 0,5 мл. Наблюдение заживотными ведется в течение трех недель. Если живот­ные заболевают или гибнут, проводится тщательное исследование для выяснения причин. Если доказано, что это не связано с исследуемым материалом, или если животные вообще не заболевают, считается, что материал не содержит вируса лимфоцитарного хориоменингита. Этот вирус может быть обнаружен ина морских свин­ках, которым исследуемый материал вводится в мозг — по 0,1мл и внутрибрюшинно— по 5 мл. Наблюдение за животными ведется в течение 42 дней.

Выявление вируса Коксаки. В опыте исполь­зуются белые мыши-сосунки, не старше суточного воз­раста. Исследуемый материал вводится им в мозг — по 0,01 мл и внутрибрюшинно — по 0,1 мл. За животными наблюдают в течение двух недель. Если они заболева­ют или гибнут позже чем через 24 часа после введения материала, их тщательно исследуют для выяснения при­чин. Исследуемый материал считается годным, если животные вообще не заболевают или если доказано, что заболевания не связаны с инокуляцией материала.

Выявление вируса В. В опыте используются кролики, которым исследуемый материал вводится внутрикожно по 0,1 мл в десять мест и подкожно по 9 мл (в общей сложности — 10 мл одному кролику). Наблю­дение за животными ведется в течение четырех недель. Материал считается годным для производства в том случае, если кролики не заболевают.

Выявление стабильности ЧДК. При ис­пользовании в производстве вирусных вакцин культур человеческих диплоидных клеток (ЧДК) проводится систематическая проверка стабильности их кариотипа. Для этого к развивающимся клеткам прибавляют кол­хицин, затем отслаивают их от стекла с помощью трипсина и готовят из них по специальной гистологиче­ской методике препараты, в которых: а) определяют процент тетраплоидии, для чего подсчитывают число хромосом в 250 метафазах, б) регистрируют хромосом­ные и хроматидные разрывы в пятидесяти метафазах, в ) фотографируют пять метафаз ианализируют их согласно принятой классификации.

Тетраплоидия не должна превышать 5 %, количество разрывов 15 %. Отклонения от нормального кариотипа являются противопоказанием к применению культуры в производстве.

Выявление туморогенной активности клеточных культур. В опыте используются сирий­ские хомяки, которым клеточная культура импланти­руется в слизистую защечного мешка, одной группе сама по себе, другой — с кортизоном. Контрольным животным таким же способом имплантируют клетки HеLa. За животными наблюдают в течение 28 дней. Культура признается непригодной для производства вакцины в том случае, если у подопытных животных развиваются макроскопические узелки, прогрессирую­щие в размерах, а в гистологических срезах из них об­наруживаются признаки злокачественного роста.

Выявление микоплазм (PPLO). В опыте используется среда следующего состава: триптический перевар бычьего сердца + 0,2 % агара + 20 % бычьей сыворотки или пептона Дифко. Исследуемая вируссодержащая жидкость засевается на эту среду. При наличии колоний PPLO микроскопируют мазки, приготовлен­ные из них. Для контроля в такие же среды засеваются известные культуры PPLO.

Поиск по сайту: