Культивирование вирусов

Вирусы размножаются только в живых клетках и эта способность обусловлена, по-видимому, тем, что они используют ферментные системы клетки для своего об­мена.

Для культивирования вирусов предложены различ­ные методы, но для получения их в больших количест­вах, для целей изготовления противовирусных специфических препаратов применяется размножение в организ­ме восприимчивых животных, в курином эмбрионе и тканевых культурах.

Метод размно­жения вирусов в организме восприимчивых животных.

Для изготовления оспенного детрита вирус вакцины размножается в коже телят. Прививочное поле 3-4 раза моют теплой водой с мылом, смачивают 70 ° алкоголем или орошают 1 % раствором лизола или 1,5 % фенола в течение 3-5 минут и потом обильно обмывают стерильной водой и обсушивают стерильным полотен­цем. После этого производят некровоточащие надрезы с промежутками в 3-5 мм. В эти надрезы втирается штамм вакцины. В течение 96-120 часов на месте внед­рения вируса развиваются специфические образова­ния — оспины, содержащие большое количество элемен­тарных телец. Соскоб с кожи и используется как мате­риал, содержащий вирус вакцины для изготовления детрита.

Для производства антирабической вакцины фикси­рованный вирус бешенства размножают в головном моз­гу кроликов, белых крыс или овец. Для этих целей используют кроликов весом в 1,5 кг, крыс — четырех-восьмидневных сосунков, а овец — в возрасте от 6 меся­цев до 1 года. Производят интрацеребральное заражение после прокола черепа шилом (кролика) или трепанации дрелью (овцы) вирусной суспензией мозга в раз­ведении 1:100. Кроликам вводят 0,2 мл, а овцам — 0,3-0,5 мл. Вся операция производится с соблюдением стерильности и дезинфекцией поля до и после зараже­ния. У животных после инкубации в 80-90 часов развивается экспериментальное бешенство, проявляю­щееся в прогрессивном расстройстве координации, а за­тем парезов и параличей конечностей. Головной мозг, содержащий большое количество фиксированного вируса бешенства, используется как для изготовления вакци­ны, так и антигена для иммунизации лошадей с це­лями производства антирабического гамма-глобулина.

Размножение вируса клещевого энцефалита произ­водят в головном мозгу белых мышей весом в 8-10 г. Животных заражают интрацеребрально 0,03-0,04 мл 10 % мозговой вирусной суспензией. В течение 3-4 дней развивается экспериментальный клещевой энцефалит, проявляющийся в параличах задних и передних конеч­ностей. В этом состоянии животных забивают, промы­вают несколько раз в 5 % карболовой кислоте и извле­кают головной мозг. Обычно вирус обнаруживается в мозгу при разведении суспензии его в 10^-7.

Метод размножения вирусов в ку­риных эмбрионах.

Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусологи­ческую практику в 30-х годах XX в. Их использование расширило спектр культивируемых в лабораторных условиях вирусов, позволило более успешно решать стоящие перед вирусологией задачи в связи с тем, что куриные эмбрионы имеют ряд преиму­ществ перед лабораторными животными.

Так, скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального заражения со стороны внешней сре­ды. Важным преимуществом эмбрионов является также их высо­кая чувствительность к широкому спектру вирусов, что объясня­ется недостаточным развитием защитных механизмов. Куриные эмбрионы - легкодоступный объект в связи с развитием широ­кой сети птицефабрик и инкубаториев. Кроме того, куриные эм­брионы экономичны, не требуют ухода и кормления.

Однако нельзя полностью гарантировать стерильность этой жи­вой системы, так как эмбрионы могут нести в своем содержи­мом вирусы и другие патогенные агенты (вирусы инфекционного брон­хита кур, ньюкаслской болезни, гриппа, лейкоза, хламидии и микоплазмы). Их присутствие может искажать результаты исследо­вания.

Используют куриные эмбрионы в вирусологии в основном для тех же целей, что и лабораторных животных, а именно:

- обнаружения в патматериале активного вируса биопробой;

- первичного выделения вируса;

- поддержания вирусов в лаборатории;

- титрования вирусов;

- накопления вируса для лабораторных исследований и полу­чения вакцин;

- как тест-объект в реакции нейтрализации.

Эффективно выделяют и культивируют на куриных эмбрионах вирусы, вызывающие заболе­вания у птиц, а также некоторые вирусы млекопитающих.

При отборе куриных эмбрионов для заражения вируссодержащим материалом к ним предъявляют следующие требования:

- эмбрионы должны быть получены из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням;

- скорлупа яиц должна быть непигментированной, чистой (мыть нельзя);

- возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения.

Строение куриного эмбриона. Обычно курица откладывает оплодотворенное яйцо, в котором зародыш находится на стадии бластулы или ранней гаструлы. При нагревании яйца до темпе­ратуры, близкой к температуре тела курицы, происходит дальнейшее развитие зародыша (рис. 1). В период с 5-го по 12-й день инкубации куриные эмбрионы могут быть использованы для за­ражения вирусами.

Яйцо с развивающимся куриным эмбрионом покрыто снару­жи твердой пористой скорлупой, к которой плотно прилегает подскорлупная оболочка.

Рис. 1.

Рис. 1. Схематический разрез куриного эмбрио­на на 8-й день инкубации:

1 - скорлупа; 2 - подскорлупная оболочка; 3 - хорионаллантоисная оболочка; 4 - аллантоисная по­лость; 5 - желточный мешок; 6 - белок; 7 - воздуш­ная камера; 8 - тело зародыша; 9 - амниотичсская полость

Последняя в тупом конце яйца разделяется на два листка, между которыми образуется воздушная камера. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, го­лова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш погружен в околоплодную жидкость, заполняющую амниотическую полость, и пуповиной связан с желтком. Желток также располагается эксцент­рично и относительно зародыша как бы по другую сторону продоль­ной оси.

Непосредственно под подскорлупной оболочкой находится аллантоисная полость, покрывающая амнион и желточный мешок, а к 10-11-му дню замыкающаяся в остром конце яйца. В процессе развития аллантоисная оболочка срастается с хорионом, образуя единую хорионаллантоисную оболочку (ХАО). В остром конце яйца находится остаток белка.

Размножение вирусов возможно во всех структурах эмбрио­на, имеющих клеточное строение, к которым относятся зародыш, ХАО и желточный мешок. Накопление вирусов происходит в тех же структурах, но ряд вирусов может накапливаться в аллантоисной и в амниотической жидкостях, образуя практически гото­вую суспензию вирусов.

Заражение в ту или другую часть эмбриона проводится в пе­риод ее максимального развития, когда количество чувствитель­ных клеток будет наибольшим.

В процессе инкубации меняются размеры зародышевых струк­тур, что во многом объясняется их функциональным назначени­ем, и определяет оптимальный для заражения возраст эмбриона. Так, желточный мешок как резервуар питательных веществ име­ет наибольший объем в начале инкубации, а затем (после 12-го дня) по мере развития зародыша он уменьшается. Заражают в желточный мешок с 5-го по 7-й день инкубации.

Амниотическая полость, являясь буферной средой развития зародыша, покрывает его уже на 5-й день инкубации. Среднее количество жидкости к середине периода инкубации составляет около 1 мл.

Для заражения в амниотическую полость используют эмбрионы в возрасте 6 - 10 дней.

Аллантоисная полость служит для сбора продуктов обмена, в ней скапливаются мочекислые соли, фосфорные и азотистые со­единения. В процессе роста и развития зародыша аллантоисная жидкость приобретает кислую реакцию. Максимальных разме­ров аллантоисная полость достигает на 9 - 12-й день развития эмбриона, поэтому заражение в аллантоисную полость прово­дят преимущественно на 9 - 11-и день инкубации.

Хорионаллантоисная оболочка богата кровеносными сосудами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности пористой скорлу­пы, насыщаются кислородом и снабжают им тело зародыша, выпол­няя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11 - 13-й день. Заражение на хорионаллантоисную обо­лочку проводят на 10 - 12-й день инкубации.

Подготовка куриных эмбрионов к заражению. Эмбрионы до­ставляют из инкубатория, не допуская их охлаждения в пути. В лаборатории эмбрионы инкубируют в термостате при температу­ре 37 °С и влажности 60 - 70 %, что достигается установлением в термостате открытых широкогорлых сосудов с водой. Вентиляци­онные отверстия термостата должны быть открыты. Эмбрионы раз­мещают воздушной камерой вверх в специальных штативах. Ре­комендуется до момента заражения дать возможность эмбрионам в течение суток адаптироваться к новым условиям и нормализо­вать свои функции после транспортного стресса. Если лаборато­рия располагает собственным инкубаторием, то снесенные кури­цей оплодотворенные яйца пригодны для закладки в него в тече­ние 10 дней.

Подготовка куриных эмбрионов к заражению включает овоскопирование и дезинфекцию скорлупы, а также соответствующую подго­товку рабочего места. Овоскопирование представляет собой просмотр яиц против достаточно яркого источника света (овоскоп), в результа­те чего на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внут­ренних структур. Овоскопирование проводят в затемненном помещении. При этом на скорлупе графитным карандашом отмечают границу воздушной камеры, место расположения зародыша и уча­сток бессосудистой зоны размером 0,5х 0,5 см.

Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего матери­ала. При овоскопировании также определяют, жив зародыш или по­гиб. Зародышей, проявляющих активные движения при хорошей кровенаполненности сосудов ХАО, считают живыми.

Заражение куриных эмбрионов. Яйца инкубируют при температуре 38-39 С°. Куриные эмбрионы заражают в асептических условиях (лучше в боксе). В предбокснике скорлупу эмбрионов обрабатывают йодированным спиртом, затем уже в боксе повторно протирают, а иногда еще и фламбируют - обрабатывают пламенем смоченного спиртом тампона.

Эмбрионы фиксируют в специальных подставках, установленных в эмалированной кювете на 3-4-слойной марлевой салфетке, смо­ченной дезинфицирующим раствором.

В работе используют инструменты, стерилизованные кипяче­нием. Их ставят в баночку со спиртом и обжигают пламенем го­релки перед каждым повторным использованием.

Заражение производится в хориоаллантоисную обо­лочку, в амниотическую полость, желточный мешок, в вену и мозг. При различных спо­собах заражения пользуются эмбрионами различных сроков (5-12 дней) инкубации.

Заражение в аллантоисную полость. При заражении этим методом хорошо размножаются вирусы гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей, везикулярного стомати­та и др. Существует несколько вариантов метода.

Первый вариант. Эмбрион фиксируют вертикально тупым кон­цом вверх. В скорлупе на стороне зародыша, а иногда с противо­положной зародышу стороны на 5 - 6 мм выше границы воздуш­ной камеры делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу вво­дят параллельно продольной оси на глубину 10 - 12 мм (рис. 3). После инъекции вируссодержащего материала иглу извлекают, а отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного стериль­ного парафина.

Второй вариант. Сделанное в скорлупе над воздушной каме­рой отверстие используют лишь для выхода части воздуха. От­верстие же для самого заражения делают на участке бессосудис­той зоны хорионаллантоисной оболочки (ХАО) со стороны за­родыша. Иглу вводят на глубину не более 2 - 3 мм. Инъецируют инфицирующую жидкость в объеме 0,1 - 0,2 мл и закрывают от­верстие парафином.

Заражение на хорионаллантоисную обо­лочку. Этот метод заражения куриных эмбрионов чаще использу­ют для культивирования эпителиотропных и пантропных вирусов оспы, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы плотоядных, болезни Ауески, катаральной лихорадки овец и др.

Рис. 2. Рис. 3.

Рис. 2. Заражение куриного эмбриона на ХАО через есте­ственную воздушную камеру (по Николау)

Рис. 3. Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость (по Николау)

Такое заражение может быть выполнено через естественную или искусственную воздушную камеру.

Для заражения через естественную воздушную камеру эмбрион помещают в штатив вертикально тупым концом вверх и в скорлупе против центра воздушной камеры вырезают круглое окно диамет­ром 15—20 мм. Через это окно пинцетом снимают подскорлупную оболочку. На обнажившийся участок ХАО наносят 0,2 мм вируссодержащей суспензии (рис. 2), отверстие закрывают лейкопласты­рем или реже покровным стеклом, укрепив его расплавленным па­рафином.

Заражение через искусственную воздушную камеру применя­ют чаще первого, так как оно обеспечивает контакт вируссодержащего материала с большей поверхностью ХАО и, следователь­но, ведет к образованию большего количества вируса. Для зара­жения эмбриона этим методом его помещают в штатив горизон­тально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отсасывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2—0,5 см сбоку, со стороны зародыша. Сложность метода в том, что, де­лая второе отверстие, необходимо осторожно снять вначале ку­сочек скорлупы, затем скользящим движением, не повреждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через образовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры (рис. 4, а). В результате че­рез боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой явля­ется ХАО (рис. 4, б).

Через боковое отверстие на поверхность ХАО наносят инфекци­онную жидкость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря. Закрывать первое отверстие нет необходимости, так как внутренний листок подскорлупной оболочки при этом методе заражения не нару­шается и продолжает выполнять роль барьера для микрофлоры ок­ружающей среды.

Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальном положении боковым отверстием вверх.

Рис. 4.

Рис. 4. Заражение куриного эмбриона на ХАО через искусственную воздушную камеру (по Николау и др.)

Рис. 5.

Рис. 5. Заражение куриного эмбрио­на в амниотическую полость (по Николау и др.)

Рис. 6.

Рис. 6. Заражение куриного эмбриона в желточный мешок (по Николау и др.)

Заражение в желточный мешок. Большей час­тью им пользуются для размножения хламидий, а также вирусов бо­лезни Марека, ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец и др. Заражают эмбрионы 5-7-дневного, а иногда и 2-3-дневного возраста (вирус лихорадки долины РИФ). Используют два варианта заражения (рис.6).

Первый вариант. Иногда путь заражения осу­ществляется на горизонтально укрепленном в штативе эмбрио­не, при этом зародыш находится внизу, а желток - над ним. От­верстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного парафина.

Второй вариант. Эмбрионы помещают в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5 - 4 см под углом 45° к верти­кальной оси в направлении, противоположном месту нахождения за­родыша.

Заражение в амниотическую полость. Для этой цели используют эмбрионы 6-10-дневного возраста. Метод используется при культивировании вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др. Есть два способа зара­жжения (рис. 5).

Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе. Яйцо помещают на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. Доказатель­ством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела заро­дыша в направлении передвижения.

Открытый способ. Скорлупу над воздушной камерой срезают так, чтобы образовалось окно диаметром 1,5 - 2,5 см. Через него пинце­том под контролем глаза снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомический (14 см) пинцет с сомкнутыми браншами ведут, про­давливая хорионаллантоисную оболочку по направлению к зароды­шу. Когда пинцет достигнет его, бранши размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну. Удер­живая левой рукой пинцет с фиксированной в нем оболочкой амнио­на, вводят вируссодержащий материал (рис. 7). Далее все оболочки опускают, окно закрывают лейкопластырем и эмбрион инкубируют в вертикальном положении.

Заражение в тело зародыша. Для заражения ис­пользуют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Известно два варианта метода.

Первый вариант. Заражают так же, как в амнион закрытым способом, с той лишь разницей, что берут острую иглу и на овоскопе показателем попадания иглы в тело считают подчинение зародыша движениям иглы.

Рис. 7.

Рис. 7. Заражение куриного эмбриона в амнион открытым способом (по Николау и др.)

Второй вариант. Заражают так же, как в амнион открытым способом: через окно в скорлупе подтягивают пинцетом тело за­родыша. Материал вводят в головной мозг или определенные участки тела. При таких методах заражения бывает значитель­ный процент неспецифической гибели эмбрионов.

Заражение в кровеносные сосуды ХАО. При овоскопировании 11-13-дневных эмбрионов отмечают крупный кро­веносный сосуд. По его ходу удаляют участок скорлупы, наносят 1 - 2 капли спирта, что де­лает на некоторое время подскорлупную обо­лочку прозрачной. Под контролем глаза на овос­копе иглу вводят в сосуд, что подтверждается его подвижностью при небольших боковых дви­жениях иглы. Обнаженный участок подскорлупной оболочки закрывают кусочком лейкоплас­тыря.

Можно материал в сосуды ввести и несколько отличающимся спо­собом. Срезают скорлупу над воздушной камерой, подскорлупную обо­лочку смачивают спиртом и в ставшие видными сосуды ХАО вводят материал. Отверстие закрывают кусочком стерильного лейкоплас­тыря.

Описанные технические приемы экспериментального заражения куриных эмбрионов не единственные, а имеют различные варианты.

Перед дальнейшей инкубацией на скорлупе зараженных любым методом куриных эмбрионов простым (графитным) карандашом пишут, чем заражен эмбрион и когда, а если нужно, то и другие сведения. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации, в процессе которой происходят реп­родукция внесенных вирусов и их накопление в соответствующих структурах. Температура инкубации эмбрионов варьирует от 33 до 38 °С в зависимости от свойств вируса, которым проведено заражение.

За эмбрионами ведут постоянное наблюдение, просматривают на овоскопе, отбирая павшие.

Гибель эмбрионов в первые 24 ч после заражения чаще всего обусловлена размножением грибов, бактериальной микрофлоры, внесенных в эмбрион вместе с инокулятом, или травмированием при заражении. Эта гибель считается неспецифической. В более поздние сроки эмбрионы гибнут в результате, как правило, раз­множения в эмбрионах вируса. Обнаружив погибшие эмбрионы, их сразу же переносят в холодильник с температурой 4°С. Такие условия, с одной стороны, способствуют сохранению активнос­ти накопившегося в эмбрионе вируса, с другой - уплотнению тка­ней и запустению сосудов, что значительно облегчает последую­щее вскрытие.

Эмбрионы инкубируют до момента максимального накопле­ния вируса. Для каждого вируса и даже штамма этот срок явля­ется определенным и варьирует в пределах от 2 до 7-8 сут. Так, для вируса ньюкаслской болезни штамма Н он составляет 2-3 дня, для того же вируса штамма В – 5 дней, для вируса инфекци­онного ларинготрахеита птиц – 5 дней и т. д. Затем все эмбрионы умерщвляют охлаждением при 4 °С в течение не менее 3-4 ч и вскры­вают.

Признаки размножения вируса в курином эмбрионе. Пока­зателем заражения эмбриона вирусом может служить его гибель в характерные для данного вируса сроки. Другой признак размно­жения вируса – патологоанатомические изменения, появляющие­ся в различных структурах эмбриона. Так, ХАО может быть отеч­ной, иметь кровоизлияния, узелки, или, как их называют, оспины. Такого рода поражения наблюдаются при заражении куриных эм­брионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауески и некоторыми другими. При этом размер и морфология оспин заметно различаются при размножении разных вирусов. Сам зародыш может отставать в росте и разви­тии от незараженных, т. е. проявлять феномен карликовости. Тело его может быть в разной степени обезвожено или мумифицирова­но, шея характерно перекручена. Названные признаки характерны для инфекционного бронхита кур. Кожа зародыша может быть гиперемирована, с кровоизлияниями. Внутренние органы также могут иметь признаки размножения вируса. Напри­мер, набухшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень куриного эмбриона – признак размножения в нем вируса гепати­та утят.

Встречаются вирусы (например, штамм В, вируса ньюкаслской болезни), которые, размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибели, ни патологоанатомических изменений. Обнаружить такой вирус можно лишь в том случае, если он обладает способнос­тью агглютинировать эритроциты, т.е. с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Явление гемагглютинации представляет собой со­единение эритроцитов в хлопья при добавлении к ним суспензии гемагглютинирующего вируса. Гемагглютинирующими свойствами обладают те вирусы, вирионы которых имеют на поверхности рецепто­ры, способные взаимодействовать с рецепторами оболочек эритроцитов. Такие вирионы адсорбируются на поверхности эритроцитов. Адсорбция одного вириона одновременно на двух эритроцитах ведет к тому, что последние оказываются соединенными между собой, а адсорбировавшийся вирион играет роль мостика между ними. Образованием таких мостиков между многими эритроцитами и объясня­ется склеивание эритроцитов в хлопья.

Образование хлопьев, видимых невооруженным глазом, можно наблюдать при смешивании капли суспензии вируса с каплей отмы­тых эритроцитов на плоской поверхности (стекла, керамики и др.). При смешивании суспензии эритроцитов и вируса в пробирке хло­пья эритроцитов оседают ровным слоем на дно в форме так называе­мого зонтика.

РГА используют для обнаружения и титрования вирусов. Хло­пья эритроцитов появляются через 5-10 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвеси эритроцитов. Положительная гемагглютинация не только указывает на присутствие вируса, но и выявляет его гемагглютинирующую активность с определенным видом эритроцитов, что может слу­жить вспомогательным диагностическим признаком.

Нередко при вскрытии эмбриона не удается обнаружить ни одного признака размножения вируса, хотя он и находится в ис­следуемом материале. Такой пассаж, как уже говорилось, назы­вается «слепым».

Вскрытие куриного эмбриона и получение вируссодержащего материала. Вскрывают куриные эмбрионы с целью обнаружения признаков размножения в них вирусов и получения вируссодер­жащего материала. Последнее требует соблюдения правил асеп­тики при вскрытии.

В зависимости от того, каким вирусом был заражен эмбрион (а значит, в какой структуре он накопился соответственно тро­пизму), вируссодержащим материалом могут служить ХАО, тка­ни зародыша, желточный мешок (его стенки), а также аллантоисная и амниотическая жидкости. В последнем случае выделение вируса наиболее удобно, так как экстраэмбриональные (аллантоисная, амниотическая) жидкости представляют, по существу, готовую суспензию вируса. Перед вскрытием скорлупу эмбриона обрабатывают йодированным спиртом (иногда еще фламбируют). Вскрытие производят в боксе, пользуясь стерильными инструментами и посудой. Скор­лупу срезают над той воздушной камерой (естественной или искус­ственной), через которую заражали.

Рис. 8. Рис. 9.

Рис. 8. Отсасывание аллантоисной жидкости (по Николау)

Рис. 9. Отсасывание амниотической жидкости (по Николау и др.)

При этом яйцо держат под неко­торым углом, чтобы скорлупа не упала внутрь. Ножницы не должны касаться и повреждать лежащую под воздушной камерой оболочку, для этого срез должен проходить несколько выше границы воздуш­ной камеры.

Обнажившуюся ХАО осматривают, приподнимая ее пинцетом с целью установления в ней патологоанатомических изменений. Часть ХАО, на которую был нанесен вируссодержащий материал, имеет обычно наиболее выраженные изменения. Для более тщательного осмотра ее и взятия этой части приподнимают пинцетом ХАО в этом месте и срезают ножницами как возможно больше. Для осмотра и взятия всей ХАО удаляют зародыш, желточный мешок и белок, а хорионаллантоисную оболочку отслаивают от внутренней поверхности скор­лупы, извлекают и переносят в стерильную чашку Петри с физраствором. Оболочку отполаскивают, а затем двумя пинцетами расправ­ляют так, чтобы она лежала в один слой и могла быть осмотрена по всей поверхности. Для того чтобы патологоанатомические измене­ния оболочки были видны более отчетливо, под чашку Петри подкладывают лист черной бумаги.

Аллантоисную жидкость в количестве до 10 мл отсасывают пи­петкой, которой прокалывают подскорлупную оболочку и ХАО над телом зародыша (рис. 8). Такое направление пипетки предотвращает случайный разрыв стенки желточного мешка и смешивание его со­держимого с набираемой аллантоисной жидко­стью.

Амниотической жидкости удается отсосать до 1 мл. Для этого после удаления аллантоис­ной жидкости пипетку вводят в амнион между головой и телом зародыша под его шеей (рис. 9).

Для получения стенки желточного мешка как вируссодержащего материала желток извлека­ют на чашку Петри, стенку его разрезают ножницами и отполаскивают от содержимого в фи­зиологическом растворе. Тело зародыша извле­кают, удерживая его за шею (рис. 10).

Рис. 10. Извлечение тела зародыша (по Николау и др.)

При вскрытии куриных эмбрионов ставят бактериологический контроль вируссодержа­щего материала посевом на МПБ, МПА, МППБ и среду Сабуро. Вируссодержащий материал хранят при минус 25°С и ниже.

Культивирование с производственными целями на куриных эмбрионах применяется для размножения ряда вирусов (осповакцины, клещевого энцефалита, гриппа, москитной лихорадки и др.). Так, для изготовления гриппозной и оспенной вакцин используют вирусы, раз­множенные на хорионаллантоисной оболочке, вакцины против москитной лихорадки — в аллантоисной полости, а вирус клещевого энцефалита культивируют в желточном мешке.

Метод размножения вирусов на культурах тканей.

Для изготовления живых и инактированных вакцин вирусы размножаются на первичных культурах тканей, а диаг­ностических препаратов также и на перевиваемых куль­турах.

Для размножения вирусов предложен ряд методов с использованием культур тканей. Такие методы, как Карреля-Берреуза (1910), культивирование кусочков ткани, фиксированных в сгустке плазмы, Меттлендов (1928) — культивирование в переживающих тканях — в настоящее время не используются не только в произ­водстве, но и в исследовательской работе. Эти методы вытеснены культивированием в однослойной культуре клеток.

Работа по культивированию клеток производится в специальных лабораториях при соблюдении высоких требований к стерильности воздуха, посуды, растворов, питательных сред. Используемая посуда должна быть нейтральной, хорошо вымытой и обезжиренной, приме­няемые реактивы - химически чистыми.

Широко применяются различные растворы химиче­ских веществ (фосфатный буферный, Хэнкса, Эрла, фе­ноловый красный, трипсина, версена др.) и антибиотики (микостатин или нистатин — 40000 ед, пенициллин и стрепотимицин 500000 ед в 1 мл). Концентраты анти­биотиков хранят в замороженном состоянии.

В качестве питательных сред используются такие, как синтетическая № 199, содержащая 20 различных аминокислот, 17 витаминов, 10 компонентов нуклеино­вой кислоты, 2 источника липоидов и 7 прочих веществ, или среда Эндерса, из таких естественных компонентов, как коровья амниотическая жидкость и, эмбриональный экстракт, лошадиная сыворотка.

В настоящее время предложено до 15 различных сред из естественных компонентов.

Обычно в питательные среды и растворы для преду­преждения бактериальных проростов в момент их ис­пользования вводят концентрат антибиотиков с таким расчетом, чтобы в 1 мл было 100 ед. пенициллина, 100 мг стрептомицина и 25-30 ед. микостатина или нистатина.

Метод однослойных культур имеет значительное пре­имущество перед первыми, двумя тем, что на них можно легко изучать процесс взаимодействия вируса с клеткой и получать большие выходы вирусной массы, что имеет большое значение в производстве.

В основе этого метода лежит получение суспензии клеток из кусочков тканей того или другого органа путем обработки их протеолитическими ферментами, которые разрушают межклеточные протоплазматические мостики. В практике для этих целей обычно ис­пользуется трипсин.

В общих чертах изготовление суспензии клеток заключается в том, что орган, клетки которого должны быть получены, разрезается на кусочки и многократно промывается фосфатно-буферным раствором для удале­ния крови. Трипсинизацию ведут в специально смонти­рованных колбах Эрленмейера на магнитной мешалке при 32 °С. Периодически (15 минут) раствор трипсина сливается и заменяется свежим до окончания отделения клеток от тканевых кусочков. Собирают до 60-80 млн. клеток с 1 г ткани органа. В даль­нейшем клетки центрифугируют при 2000 об/мин в те­чение 30 минут для удаления трипсина. Клетки суспендируют в подогретой до 37 °С питательной среде и подсчитывают при помощи камеры Горяева или других. В зависимости от используемой посуды берут различ­ное количество клеток (для 1,5-литровых матрацев - 750000, матрацев Ру - 100000 и пробирок - 400000) в 1 мл. В 1,5 литровые матрацы наливают 200 мл, в матрацы Ру — 100 мл и в пробирки — 0,5 мл указанной выше концентрации суспензии клеток в питательной среде. Выращивание производится при 37 °С в течение 5-7 дней.

Клетки продуцируют, в том или другом количестве в зависимости от вида, клейкое белковое вещество, при помощи которого они прикрепляются к стеклу. В ре­зультате размножения они покрывают в виде одного слоя всю поверхность сосуда, в котором производится выращивание.

При необходимости клетки суспендируют, пользуясь такими физическими приемами, как встряхивание или соскабливание со стекла пластмассовой пластинкой или резиной, укрепленной на стеклянной палочке. Если физическими методами не удается снять клетки, прибе­гают к использованию химических приемов: действием протеолитических энзимов (трипсин) или поверхностно-активных агентов (версен).

Для культивирования вирусов применяют первичные культуры многих тканей (клетки первого пассажа из ткани органа), в особенности куриного эмбриона, почки обезьяны и эмбриона человека.

Наряду с первичными культурами тканей использу­ются и культуры перевиваемых клеток (особые штаммы клеток, поддерживаемые в искусственных условиях), обычно полученные из отдельных клонов (поколение от­дельных клеток). В настоящее время предложено около 50 штаммов из нормальных тканей человека и различ­ных животных и более 10 штаммов раковой ткани чело­века и животных.

Перевиваемые культуры тканей имеют ряд преиму­ществ перед первичными. Так, они свободны от посто­ронних вирусов, обычно обладают более широким спек­тром чувствительности к инфицирующим агентам, луч­ше переносят повышенные концентрации антибиотиков работа с ними значительно проще и требует меньших материальных затрат.

В последнее время у перевиваемых культур тканей обнаружена еще одна положительная черта — спо­собность роста в суспендированном состоянии. Показа­но, что, по крайней мере, три перевиваемых штамма мо­гут быть размножены глубинным методом, если выра­щивание производить при вращении сосуда, в котором находится суспензия клеток, со скоростью 300 об/час. Добавление в среду выращивания 0,1 % метилцеллюлозы способствует сохранению клеток в суспензии. Пред­ложен ряд аппаратов для этих целей. Широко использу­емая в ряде зарубежных лабораторий ротационная качалка типа Броневик обеспечивает во флаконах с культурой воронкообразное движение среды, так как аппарат развивает скорость вращения до 1300 об/час.

Исследования, проведенные в этом направлении в Томском институте вакцин и сывороток, показывают, - что нет необходимости создавать такие скорости для культур, выращиваемых в суспендированном состоянии. В последнее время для глубинного метода размножения клеток разработан специальный тип реактора. Считают, что этот метод является наилучшим, для получения больших количеств клеток.

Несмотря на ряд преимуществ, у перевиваемых культур клеток, использование их при производстве вирусных препаратов ограничено, так как многие при­знают, что в основе превращения клеток в перевивае­мые, при длительном культивировании, лежит их злокачественное перерождение.

В связи с этим перевиваемые культуры тканей не используются для размножения вирусов с целями производства из них препаратов, вводимых в организм че­ловека.

При размножении вируса в культуре ткани наблюда­ются две формы взаимодействия клеток с внедрив­шимся и репродуцирующимся в них вирусом — острая и латентная инфекции. Острая форма инфекции сопро­вождается деструкцией клетки и в ряде случаев распа­дом ее; этот процесс носит название цитопатогенного действия. Форма этой деструкции бывает различной в зависимости от вируса ее вызвавшего.

При латентной форме инфекции размножение виру­са не вызывает гибели клеток и внешне они могут не отличаться от незараженных культур.

Механизм взаимодействия вируса с клеткой заклю­чается в адсорбции его чувствительной клеткой, проник­новении вируса или его нуклеиновой кислоты в клетку, синтезе в ней вирусных, частиц и выделении их из клет­ки. Показано, что вирус в питательной среде появляется после фазы созревания в клетке, продолжающейся при­мерно 4 часа, после чего начинается медленное его выделение в среду. Заражение свежих клеток в зависимо­сти от вида вируса происходит или через среду или в основном путем контакта здоровой клетки с зара­женной.

В связи с тем, что одновременно заражаются не все клетки, да и процесс размножения их в культуре имеет место, инкубация посевов в термостате производится в течение двух и более суток, в зависимости от вида вируса и культуры ткани. Так при изготовлении ткане­вой культуральной противоэнцефалитной вакцины вирус клещевого энцефалита выращивается на первичной культуре клеток куриного эмбриона 48-55 часов. Для увеличения выхода вируса можно производить два сбо­ра — после двухсуточного культивирования питательная среда, содержащая вирус, сливается, а на слой клеток в матрацы наливается свежая порция, и выращивание вновь продолжается в течение установленного срока.

Культивирование бактериофагов осуществляется на культурах микробов (бактерий, актиномицетов), в клет­ках которых они интенсивно размножаются.

Метод размножения вирусов в культурах клеток

Культура клеток - это клетки многоклеточно­го организма, живущие и размножающиеся в искусственных услови­ях вне организма (in vitro).

Методика культивирования клеток особенно успешно стала раз­виваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращаю­щих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) – удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных культур клеток.

В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток: первично-трипсинизированные культуры клеток – клетки, полу­ченные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных ор­ганов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Для получения первичных клеток от здорового животного не поз­днее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1 - 4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивиру­ют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37 °С.

Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмичес­кого роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция).

На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными).

Обычно монослой формируется через 3-5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факто­ров.

Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7-21 дня (в зависимости от вида клеток и состава пита­тельной среды).

Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10). Лучше для этой цели использовать инвертированный микро­скоп.

Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).

Субкультуры. В вирусологической прак­тике часто используют субкультуры, кото­рые получают из первичных клеток, выра­щенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной сре­де и пересева на новые матрасы или про­бирки. Через 2-3 сут формируется моно­слой.

Практически субкультуру можно полу­чить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительно­сти к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявле­ния контаминации клеток вирусами. Суб­культуры получают от 2-5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8-10. Последу­ющие пассажи приводят к изменению мор­фологии клеток и их гибели. Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на ста­дии перехода к перевиваемым культурам клеток.

Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к раз­множению вне организма неопределенно длительное время. В лабо­раториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в дру­гой (при условии замены питательной среды).

Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по полу­чению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток – результат генетической изменчивости клеток или селек­ции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидпый), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использова­ние перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин.

Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Среди них наиболее широко используют следующие линии клеток: HeLa (из раковой опухоли шейки матки женщины); Нер-2 (из карциономы гортани челове­ка); KB (из раковой опухоли полости рта); ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); TR (из слизистой трахеи коровы); L (мышиные фибробласты). СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус) и др. Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и матери­альные средства; эти культуры заранее можно проверить на нали­чие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспе­чивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные куль­туры.

Однако перевиваемые клетки имеют и недостатки: они склонны к малигнизации, т. е. злокачественное перерождение независимо от происхождения и снижения чувствительности к вирусам у них про­исходит быстрее, чем у первичных, поэтому необходимо применять клональные линии перевиваемых клеток.

Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для оче­редного пересева отбирают 2-3-дневную культуру с хорошим монослоем, сливают питательную среду, а клеточный монослой покрывают подогретым до 35-37°С 0,02%-ным раствором версена. Под действием версена клетки округляются, отделяются от стекла. Через 10-15 мин. после округления клеток версен сливают, оставляя небольшое количество, и выдерживают еще 5-10 минут. Затем добавляют небольшое количество питательной среды. После встряхивания подсчитывают клетки в камере Горяева, исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации (80-200 тыс. в 1 мл.) и разливают при помешивании в пробирки, закрывают резиновыми пробками и культивируют в термостате при 37 ºС в течение 3-4 дней до образования сплошного монослоя. Состав питательной среды зависит от вида клеток, но чаще при культивировании перевиваемых клеток используют среды Игла, 199 или смеси этих сред с гидролизатом лактальбумина.

Диплоидные культуры клеток. Это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся в процессе пассирования кариотипом, свойственным исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморагенной активностью при трансплантации хомячкам.

Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, питательные среды высокого качества, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии. Диплоидные клетки получают из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почки эмбриона крупного рогатого скота, свиней, почки хомяка).

Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пасса­жей 50±10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (- 196 °С) и при необходимости вос­становить.

Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемы­ми и первичными клетками: 10-12 дней они могут быть в жиз­неспособном состоянии без смены питательной среды; при сме­не среды один раз в неделю остаются жизнеспособными в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования ви­русов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к ви­русам.

Суспензионные культуры клеток. В 1953 г. Оуэне с сотрудниками показали способность клеток размножаться в свободносуспендированном состоянии. В последующие годы этот метод был значительно усовершенствован: была создана современная аппаратура, обес­печивающая размножение клеток со строго заданными парамет­рами (температура, рН, скорость перемешивания), а также адап­тированы многие линии перевиваемых клеток к размножению в этих условиях (ВНК-21, Нер-2, МДВК и др.). Выращивание виру­сов в суспензионных культурах клеток открывает большие возмож­ности в промышленном производстве вакцин и диагностикумов. Однако только перевиваемые клетки хорошо культивируются в сус­пензии.

Новый подход к культивированию клеток в суспензии – приме­нение микроносителей (сефадекс, силикагель, цитолар и др.). На мик­роносителях культивируемые клетки формируют монослой. Таким образом, этот способ позволяет методами суспензионного культиви­рования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстра­ту клетки: первичные, субкультуры, диплоидные. Эти клетки приня­то называть поверхностно зависимыми.

Способ культивирования на микроносителях в настоящее время чрезвычайно популярен, так как он открывает большие перспективы в клеточной биотехнологии, в получении вакцин и других биологи­чески активных веществ (интерферон, гормоны и т. д.).

Хранение культур клеток. Каждый из трех основных типов кле­точных культур - первичных культур, диплоидных штаммов и пе­ревиваемых линий клеток, используемых в вирусологических иссле­дованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжи­тельном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.

Наиболее простой метод консервирования культур клеток – хранение их при 4°С до 1-6 недель. Успешно применяют хранение клеточ­ных штаммов в условиях сухого льда (минус 78 °С) и жидкого азо­та (минус 196 °С). Для этого клетки снимают с матрасов, суспендируют в концентрации 10⁶ в 1 мл питательной среды, содержащей в качестве защитных веществ 10 - 40 % сыворотки и 10 % очищен­ного стерильного глицерина (вместо глицерина успешно применя­ют ДМСО - диметилсульфоксид). Затем клеточную суспензию раз­ливают в ампулы, запаивают и выдерживают 1-3 ч при 4°С, после чего замораживают клетки в смеси этилового спирта с сухим льдом. Скорость охлаждения не должна превышать 1°С в 1 мин. При сни­жении температуры до минус 25 °С ампулы помещают для хране­ния в сухой лед. Если для хранения используют жидкий азот, то ампулы с клетками охлаждают до минус 70°С и кладут в жидкий азот. Хранение клеток в жидком азоте в течение ряда лет не изменяет их пролиферативную активность и чувствительность к вирусам.

Восстанавливают замороженные клетки следующим образом. Ампулу с замороженными клетками быстро погружают в водяную баню на 1-2 мин при легком встряхивании, затем клетки выливают в матрас, добавляют соответствующее количество ростовой среды и культивируют в термостате при 37°С. Для удаления глицерина или ДМСО питательную среду заменяют на следующий день после по­сева.

При транспортировке клеток матрасы с выросшим монослоем за­ливают средой доверху и закрывают резиновой пробкой. В лаборато­рии питательную среду сливают и используют при культивировании этих клеток в виде добавок к питательной среде, применяемой в дан­ной лаборатории.

Можно транспортировать и клеточную суспензию при 4°С. При благоприятных условиях транспортировки, исключающих перегре­вание и замораживание клеток, 80-90 % из них сохраняют жизне­способность до 7-8 дней.

Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды, соответствующих растворов, пита­тельных сред и высокого качества воды.

Контаминация культур клеток. Работа с культурами клеток, их использование в вирусологических и других исследованиях, в био­технологии требуют постоянного контроля на отсутствие посторон­них агентов (контаминантов). Контаминантами могут быть вирусы, бактерии, грибы, микоплазмы и клетки других клеточных культур. Микоплазмы – одни из наиболее частых контаминантов, особенно в перевиваемых линиях клеток. Своевременное выявление их, дру­гих микроорганизмов или вирусов в культуре клеток – важное условие поддержания высокого качества последней. Паспортизация стабильных клеточных линий предусматривает в качестве необходи­мого теста контроль на отсутствие микоплазмоконтаминации, что должно стать обязательным для всех лабораторий, где работают с культурами клеток.

Резкое закисление питательной среды в культуральных флаконах и опалесценция ее могут быть следствием контаминации культур клеток микоплазмами. Для выявления последних используют следу­ющие методы: посев на питательные среды, тест-культуры, цитоло­гические, радиоавтографические и электронно-микроскопические.

В случае контаминации клеточные культуры уничтожают, а культивирование возобновляют из резервных расплодок, хранящихся в жидком азоте. Только редкие и уникальные культуры подлежат деконтаминации.

Предупредить размножение и подавить случайно попавшие в клеточную культуру бактерии удается с помощью противомикробных препаратов (антибиотиков и др.), добавляемых в росто­вые среды непосредственно перед их использованием. Эти пре­параты следует строго дозировать и применять дифференциро­вание. Их использование – необходимое условие при возрастании риска контаминации в процессе получения первичных культур клеток при крупномасштабном суспензионном выращивании кле­ток, массовом производственном культивировании перевиваемых клеток, а также во всех случаях объединения клеточного мате­риала.

При работе с культурами клеток используют многие антимикробные (нетоксичные) препараты в оптимальных дозах. Выбор эффективного препара­та или комплекса препаратов зависит от чувствительности к ним конкретных контаминантов.

Поиск по сайту: