ГЛАВА 11. АГГЛЮТИНИРУЮЩИЕ, ПРЕЦИПИТИРУЮЩИЕ, ГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ И ЛЮМИНИСЦИРУЮЩИЕ СЫВОРОТКИ. КОМПЛЕМЕНТ

Диагностические иммунные сыворотки широко при­меняются для определения вида или типа микроба, вы­деленного от больного или носителя и для определения природы неизвестного белка при условии, если его можно получить в коллоидном состоянии. Приготовле­ние диагностических сывороток в принципе не отлича­ется от приготовления лечебно-профилактических сы­вороток. В зависимости от характера антигена, послу­жившего для иммунизации животного, сыворотка по­следнего приобретает различные свойства.

Специфические свойства иммунных сывороток могут быть обнаружены путем изучения действия их на соот­ветствующие антигены. В зависимости от условий опыта у таких сывороток можно наблюдать агглютинирующее (склеивающее), преципитирующее (осаждающее) и литическое (растворяющее) действие. Применительно к на­блюдаемым феноменам принято говорить о соответ­ствующих иммунных телах, содержащихся в сыворот­ках: агглютининах, преципитинах, лизинах и пр.

Агглютинирующие сыворотки

При идентификации микробов, наряду с определени­ем морфологических, культуральных и биохимических свойств их, широко используются диагностические аг­глютинирующие сыворотки. Агглютинацией называется склеивание микробов, скучивание их под влиянием спе­цифических антител — агглютининов, содержащихся в иммунной сыворотке.

Реакция агглютинации в настоящее время является наиболее часто применяемой, нередко единственной в смысле определения и выделения различных видов из группы морфологически неотличимых бактерий. Микроб­ная клетка является сложным комплексом антигенов, что является причиной так называемой групповой агглю­тинации, выражающейся в том, что иммунная сыворотка агглютинирует не только гомологичный микроб, но и другие бактерии из той же группы. Групповая агглюти­нация затрудняет определение вида выделенного микро­ба и серологическую диагностику заболевания.

Устранить групповую агглютинацию можно, удалив из сыворотки антитела в отношении антигенов, являю­щихся общими для гомологичного микроба и для род­ственных с ним. Это достигается путем смешения не­большого количества сыворотки с густой взвесью мик­робов, дающих групповую агглютинацию, что ведет к адсорбции на их поверхности соответствующих анти­тел. В жидкости, полученной после центрифугирования, остаются антитела лишь в отношении гомологичного микроба.

Иммунные сыворотки, лишенные антител к группо­вым антигенам и сохранившие лишь антитела к тому специфическому антигену, которым характеризуется го­мологичная культура, получили название монорецепторных.

Антитела, обусловливающие агглютинацию бактерий и иных клеток, получили название агглютининов, а сы­воротки, содержащие эти антитела, агглютинирующих. Сыворотки получаются путем иммунизации живот­ных соответствующими микробами. В качестве проду­центов агглютинирующих сывороток могут быть использованы кролики, бараны, козы, ослы и лошади. Наиболее свободными от неспецифических антител являются сыворотки кроликов.

Для иммунизации животных можно применять жи­вые и убитые культуры, являющиеся типичными по своим морфологическим, культуральным, биохимиче­ским, серологическим и антигенным свойствам. Лучшие результаты получаются при применении формалинизированных и обработанных парами формалина микроб­ных взвесей. Иммунизацию проводят путем введения антигена в краевую ушную вену, начиная с 500 млн. микробных тел в 1 мл и увеличивая дозу вдвое при последующих введениях. Для получения полноценных сывороток обычно бывает достаточно 3—4 инъекций с интервалами в 5 дней. На 5—7 день после третьей иммунизации берется проба крови и проверяется титр сыворотки. Титром сыворотки считается то наибольшее ее разведение, с которым получается реакция агглюти­нации соответствующей культуры, оцениваемая тремя крестами при помощи агглютиноскопа. При получении недостаточного титра, кролик подвергается 4-й иммуни­зации в той же дозе или в удвоенной, в зависимости от веса и состояния животного.

Если титр сыворотки оказывается достаточным, то в тот же день у кролика производится кровопускание. Кровь можно получить тремя способами: 1) из ушной вены, 2) из сердца, 3) из сонной артерии (тотальное кровопускание).

На наружной поверхности уха в месте сплетения кро­веносных сосудов делается надрез бритвенным ножич­ком и кровь по каплям собирается в большую стериль­ную пробирку. После взятия крови кролику подкожно вводится стерильный физиологический раствор (не менее половины объема взятой крови). Взятие крови из уха кролика следует производить 2 раза с интервалом в 2 дня. За два кровопускания от одного кролика получается 80—120 мл крови.

Взятие крови из сердца производится однократно, в количестве 40—60 мл. Козам, ослам и баранам анти­ген первый раз вводится подкожно, а в дальнейшем внутривенно, с интервалами в 5 дней. У крупных живот­ных (бараны, козы, ослы, лошади) кровопускание про­изводится через яремную вену.

Полученная кровь ставится на 10—15 минут в термо­стат, образовавшийся сгусток отделяется от стенок про­бирки, после чего кровь выдерживается в течение 24—48 часов в рефрижераторе при температуре 4—8 °С. В настоящее время от крупных животных (лошади, ослы и др.) кровь берут в бутыли с цитратным раство­ром. Плазму дефибринируют раствором хлористого кальция.

К полученной сыворотке добавляется консервант. Сыворотка (в нативном виде) выдерживается не менее 1 месяца при температу­ре 4—8 °С для стабилизации титра, после чего опре­деляется окончательный титр ее к гомологичным штам­мам и. наличие групповой реакции путем постановки ре­акции агглютинации с набором соответствующих живых культур в количестве 3—5 штаммов каждого вида. Титр групповых агглютининов не должен превышать 1/8 тит­ра к гомологичным культурам.

Институтами вакцин и сывороток выпускаются неадсорбированные и адсорбированные агглютинирующие сыворотки. Специфические адсорбированные агглютинирующие сыворотки получают путем удаления методом адсорбции неспецифических и групповых антител из нативныхсывороток. Использование адсорбированных сывороток дает возможность определения выделенного микроба в пределах вида или типа при помощи реакции агглютинации на стекле без дополнительной постановки развернутой агглютинации.

Для адсорбции агглютинирующих сывороток в каче­стве адсорбента могут применяться живые и убитые бактерии. Наилучшей адсорбционной способностью об­ладает живая культура, содержащая все антигенные компоненты в неизмененном виде. Полученные микроб­ные взвеси перед употреблением центрифугируются в необходимом количестве и добавляются к адсорбируе­мой сыворотке. Адсорбцию сывороток следует начинать адсорбентами, имеющими близкое родство с культурой, примененной для получения данной сыворотки. Количе­ство добавленного антигена зависит от вида или типа истощаемой сыворотки и от ее количества.

Сыворотка с адсорбентом помещается в термостат при 37 °С на срок от 2 до 18 часов и затем в рефрижератор до следующего дня. Истощаемая сыворотка после каж­дой адсорбции проверяется в реакции агглютинации на стекле как с культурами того вида, которыми ведется истощение, так и с культурами, реагировавшими с ней при первоначальном контроле, а также с гомологичными, культурами.

Полностью адсорбированные сыворотки освобожда­ются от микробных тел путем центрифугирования или сепарирования. Если к нативной сыворотке не добавлял­ся консервант, то к полученной серии сыворотки следу­ет добавить 1—2% перекристаллизованной борной кис­лоты. Затем сыворотка фильтруется через стерилизую­щий бактериальный фильтр и после выдерживания в течение 2-х суток при комнатной температуре испытывается на стерильность, специфичность и высоту титра.

Контроль на специфичность адсорбированных агглю­тинирующих сывороток проводится до и после фильтро­вания — реакцией агглютинации на стекле и развернутой реакцией агглютинации с гомологичными и гетерологичными культурами. Ясно выраженная положитель­ная реакция агглютинации, получаемая с 3—5 гомоло­гичными культурами в течение 1 минуты при комнатной температуре, при отсутствии реакции агглютина­ции с культурами других серологических типов в течение 20 минут служит критерием для выпуска адсорбирован­ных сывороток. Диагностические агглютинирующие сы­воротки разливаются по 1 мл в соответствующие ампу­лы, которые упаковываются по нескольку штук (не более 10) в коробку.

Агглютинирующие сыворотки необходимо хранить в темном сухом месте при 4—10 °С. При правильном содержании сыворотка сохраняет свою активность в те­чение одного года со дня изготовления.

Агглютинирующие адсорбированные сыворотки вы­пускаются и в сухом виде. Сыворотки перед высушива­нием в стерильных условиях разводят сахарозо-желатиновой средой, разливают по 1 мл в стерильные ампулы и высушивают из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума.

Преципитирующие сыворотки

Преципитирующие сыворотки применяются для по­становки реакций преципитации с целями диагностики некоторых инфекционных заболеваний, для определения природы неизвестного белка при условии, если его можно получить в коллоидном состоянии, в судебно-ме­дицинской практике для распознавания видовой принад­лежности крови, в санитарии, химии и т. д.

Реакция преципитации характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет обнаружить ничтожные следы антигена (до разведения 1:100000 и выше). Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих.

Преципитирующие сыворотки получаются путем искусственной иммунизации животного живыми или уби­тыми микробами, а также разнообразными лизатами иэкстрактами микробных клеток. Путем искусственной иммунизации можно получить преципитирующие сыво­ротки к любому чужеродному белку растительного и животного происхождения, а также к гаптенам при иммунизации животного полноценным антигеном, содер­жащим данный гаптен.

Наилучшие преципитирующие сыворотки получаются при иммунизации полным антигеном или соляно-кислой вакциной. Применяемую для иммунизации животных экстрагированную соляно-кислую вакцину готовят сле­дующим образом: густой смыв суточной культуры дваж­ды промывают (при центрифугировании) физиологиче­ским раствором и обрабатывают десятикратным коли­чеством 0,2 N соляной кислоты в течение 18—24 часов при температуре 37 °С. Затем центрифугируют, полученный осадок микробных тел дважды промывают физиологи­ческим раствором и нейтрализуют 25 % раствором углекислой соды. Полученную вакцину оставляют в виде осадка.

По мере надобности из этого осадка готовят взвесь в физиологическом растворе, содержащую необходимое для иммунизации количество микробных тел, определяе­мое по оптическому стандарту. При такой обработке в вакцине остается часть полного антигена и происходит разрушение лабильных токсических белков, в резуль­тате чего сохраняется антигенность и достигается относительная атоксичность препарата.

Преципитирующие сыворотки готовятся подобно аг­глютинирующим, только выпускаются они с высокими титрами, не ниже 1:100000, что достигается более дли­тельной иммунизацией животных. Небольшие дозы (0,5 мл) антигена вводятся в течение 2—3 недель по 3 дня подряд с перерывом в 4 дня. Более массивные дозы (1 – 2 - 3 мл) вводятся с интервалами в 4—6 дней по 8 – 12 - 16 раз. Значительной эффективностью облада­ет разделение иммунизации на несколько циклов, из ко­торых один производится внутривенно (6—8 инъекций по 1—2 мл), а другой — крупными дозами внутрибрюшинно (6—8 инъекций по 3—5 мл). Кровопускание про­изводится на 8—12-й день после последнего введения ан­тигена. Полученная сыворотка консервируется добавле­нием 1—2 % сухой борной кислоты или 0,5 % хлороформа. Готовый препарат контролируют на специфичность, стерильность и высоту титра. При титровании преципитирующей сыворотки определяется то предельное раз­ведение антигена, которое может быть обнаружено при помощи цельной или разведенной иммунной сыворотки.

Гемолитическая сыворотка

Гемолитическая сыворотка представляет собой сыво­ротку кролика, иммунизированного отмытыми эритроцитами барана. Гемолитическая сыворотка самостоятельно для серологического диагноза инфекционных болезней не применяется, а используется как составная часть ге­молитической системы при постановке реакции связыва­ния комплемента.

Иммунизация кроликов проводится отмытыми эрит­роцитами барана с интервалами в 48 часов. Каждый кролик получает в ушную вену 4 инъекции бараньих эритроцитов в повышающейся концентрации:

1 инъекция—3 мл 25 % взвеси бараньих эритроцитов,

2 инъекция—3 мл 50 % взвеси бараньих эритроцитов,

3 инъекция—3 мл 75 % взвеси бараньих эритроцитов,

4 инъекция—3 мл 75 % взвеси бараньих эритроцитов.

Через 6 дней после последней инъекции у кроликов берется кровь из ушной вены в два приема с интерва­лом в один день в количестве 60—80 мл. Кровь оставляется при комнатной температуре на 1—2 часа, затем при температуре 3—6 °С на 20—24 часа. На следующий день сыворотку отсасывают после центрифугирования в стерильную колбу.

Полученная гемолитическая сыворотка инактивируется 30 минут при 55—56 °С и консервируется добавлением сухой борной кислоты из расчета 3 % или карбол-глицерина из расчета 100 мл консерванта на 1 литр сыворотки.

Консервированная сыворотка выдерживается в лед­нике в течение 5 дней, после чего титруется.

Титром гемолитической сыворотки называется се максимальное разведение, способное в объеме 0,5 мл рас­творить 0,5 мл 3 % взвеси бараньих эритроцитов в при­сутствии 0,5 мл разведенного комплемента в течение 1 часа при температуре 37 °С.

Гемолитическая сыворотка должна быть прозрачной с титром не ниже 1:1200, способной лизировать ба­раньи эритроциты только в присутствии комплемента. Гемолитическая сыворотка разливается в ампулы емко­стью 1—2 мл и хранится при температуре 3—5 °С. Срок годности 6 месяцев.

Антивирусные сыворотки

Диагностические антивирусные сыворотки получили широкое распространение для определения вида и типа выделенного вируса. Изготовление антивирусных диаг­ностических сывороток не отличается от изготовления антибактериальных.

Получение антивирусных сывороток проводят на оп­ределенном виде животных (кролики, морские свинки, крысы и др.), что связано с особенностями того или иного вируса. Животные, чаще кролики, иммунизируют­ся живым или инактивированным вирусом:

После нескольких иммунизаций у животных берут кровь и определяют количество антител в сыворотке. Сила диагностической противовирусной сыворотки опре­деляется ее титром, т. с. наибольшим разведением, даю­щим соответствующую реакцию иммунитета.

Диагностические антивирусные сыворотки использу­ются в постановке реакций преципитации, связывания комплемента, нейтрализации вируса и реакции тормо­жения гемагглютинации. Наибольшее распространение получили реакции нейтрализации, связывания компле­мента и торможения гемагглютинации.

Люминесцирующие сыворотки

Люминесцирующие сыворотки применяются для мик­робиологической диагностики ряда инфекционных забо­леваний, а именно для обнаружения бактерии, вирусов, риккетсий и простейших, для определения локализации антигенов в организме, тканевых срезах и пр. Во многих микробиологических исследованиях широко использует­ся метод люминесцирующих антител. Этот метод, осно­ванный на сочетании иммунологической специфичности реакции между антигеном и антителом и люминесцент­ной микроскопии, позволяет обнаруживать и идентифи­цировать бактерии, вирусы, риккетсии, грибки, простей­шие и растворенные антигены в микроскопическом препарате.

Люминесцентно-серологический метод обладает вы­сокой чувствительностью, достаточно специфичен, от­личается простотой проведения и позволяет быстро получить ответ.

Люминесцирующие сыворотки готовят из специфиче­ских иммунных сывороток, которые в свою очередь по­лучают подобно агглютинирующим и преципитирующим сывороткам. Из них извлекают глобулиновую фракцию методом высаливания сернокислым аммонием. Получен­ные глобулины обрабатывают флюорохромами, изоцианатом флюоресцеина или изотиоцианатом флюоресцеина в соотношении 3 мг красителя на 100 мг белка. Обра­ботанные таким образом белки-антитела обладают способностью люминесцировать (светиться) в ультра­фиолетовых или фиолетово-синих лучах. Такие люминесцирующие антитела используются для обнаружения со­ответствующего микроба (антигена). Наличие и локализация микробов (антигена) в микроскопическом препарате выявляются в результате реакции антиген — антитело. Продукт этой реакции ярко люминесцирует и может быть открыт даже в отдельных участках клеток и в единичных бактериях. Единичные клетки возбудите­лей могут быть идентифицированы в мазках па фоне обильной посторонней микрофлоры.

Помимо описанных люминесцирующих сыворо­ток в микробиологической практике широко применяют­ся люминесцирующие нормальные сыворотки разных видов животных и человека. Эти сыворотки использу­ются при непрямом методе определения антигенов и антител. Они служат для обнаружения комплексов антиген 4- антитело и являются антисыворотками против глобулинов сыворотки того вида животного, которое иммунизировалось для получения специфической сыво­ротки. В основном применяется люминесцирующая противокроличья сыворотка, иногда люминесцирующие противолошадиная и противочеловеческая сыворотки.

Непрямой метод использования люминесцирующих антител заключается в том, что на препарат, содержа­щий микроба (антиген), наносят специфическую иммунную сыворотку. Молекулы гамма-глобулинов из приме­ненной сыворотки, взаимодействуя с гомологичным антигеном, специфически адсорбируются в местах лока­лизации его и обнаруживаются с помощью люминесцирующей антигамма-глобулиновой сыворотки.

Получение люминесцирующей противокроличьей или противолошадиной сывороток осуществляется путем иммунизации петухов (в первом случае) или кроликов, ослов гамма-глобулиновой фракцией нормальной сы­воротки. Полученная видовая иммунная сыворотка обрабатывается флуорохромами.

Люминесцирующие диагностические сыворотки, вы­сушенные методом лиофильной сушки, сохраняют свою активность при комнатной температуре более года.

В настоящее время разработаны методы производст­ва люминесцирующих глобулинов: антирабического, сыпно-тифозного, Ку-риккетсиозного, бруцеллезного, туляремийного, сибиреязвенного, противочумного, дизен­терийного (Зонне и Флекснера), холерного и др., а также люминесцирующих антисывороток, против глобули­нов кролика, морской свинки, лошади, барана и чело­века — для непрямого иммунолюминесцентного метода.

Комплемент

Комплемент — это совокупность нескольких нормаль­ных компонентов свежей сыворотки с различными фи­зико-химическими свойствами. Природа комплемента не вполне ясна.

Он содержится в большинстве сывороток теплокров­ных и холоднокровных животных. Комплементарная функция выражена наиболее интенсивно в сыворотке морских свинок, поэтому последние и служат в лабора­ториях донорами комплемента.

Основным свойством комплемента является его спо­собность вызывать лизис клеток, сенсибилизированных соответственными иммунными сыворотками, а также адсорбироваться системами антиген + антитело.

Комплемент широко применяется в медицинской и ветеринарной практике для серологической диагностики ряда инфекционных заболеваний в постановке реакции связывания комплемента (сифилис, гонорея, бруцеллез, сап, туляремия, проказа, актиномикоз, риккетсиозы, грипп, клещевой энцефалит и др.).

Для получения комплемента используются морские свинки весом 400—600. Кровь у них берут из сердца в количестве 6—8 мл, после чего подкожно вводят фи­зиологический раствор. Взятие крови у одной и той же морской свинки производится не чаще 1 раза в 15—20 дней. Для получения одной серии комплемента делается смесь сыворотки от 30—50 свинок. Обработка крови для получения сыворотки производится обычным, описанным выше способом.

Консервантом в жидком комплементе является смесь из 4,5 % раствора борной кислоты и сернокислого нат­рия. Сила комплемента определяется его титром, т. е. наименьшей дозой, способствующей полному гемолизу 1 мл сенсибилизированных бараньих эритроцитов. Для постановки реакций иммунитета (гемолиз, бактериолиз, РСК) берут рабочую дозу комплемента, которая на 20—30 % превышает вытитрованную минимальную дозу, так как в реакциях активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиента­ми (антигеном, сывороткой).

Комплемент пригоден к отпуску при титре от ОД до 0,25 в разведении 1:10. Он должен быть прозрачным, негемолизированным, обладать способностью адсорби­роваться комплексом антиген + антитело и не быть гемотоксичным.

Комплемент выпускается в жидком виде со сроком годности в 2 месяца при условии хранения при темпера­туре 3 °С — 6 °С и.в высушенном состоянии со сроком год­ности в 3—4 года.

Препарат сухого комплемента сохраняется при обыч­ной комнатной температуре.

Поиск по сайту: