 |
юБРНюБРНЛЮРХГЮЖХЪюПУХРЕЙРСПЮюЯРПНМНЛХЪюСДХРаХНКНЦХЪаСУЦЮКРЕПХЪбНЕММНЕ ДЕКНцЕМЕРХЙЮцЕНЦПЮТХЪцЕНКНЦХЪцНЯСДЮПЯРБНдНЛдПСЦНЕфСПМЮКХЯРХЙЮ Х ялххГНАПЕРЮРЕКЭЯРБНхМНЯРПЮММШЕ ЪГШЙХхМТНПЛЮРХЙЮхЯЙСЯЯРБНхЯРНПХЪйНЛОЭЧРЕПШйСКХМЮПХЪйСКЭРСПЮкЕЙЯХЙНКНЦХЪкХРЕПЮРСПЮкНЦХЙЮлЮПЙЕРХМЦлЮРЕЛЮРХЙЮлЮЬХМНЯРПНЕМХЕлЕДХЖХМЮлЕМЕДФЛЕМРлЕРЮККШ Х яБЮПЙЮлЕУЮМХЙЮлСГШЙЮмЮЯЕКЕМХЕнАПЮГНБЮМХЕнУПЮМЮ АЕГНОЮЯМНЯРХ ФХГМХнУПЮМЮ рПСДЮоЕДЮЦНЦХЙЮоНКХРХЙЮоПЮБНоПХАНПНЯРПНЕМХЕоПНЦПЮЛЛХПНБЮМХЕоПНХГБНДЯРБНоПНЛШЬКЕММНЯРЭоЯХУНКНЦХЪпЮДХНпЕЦХКХЪяБЪГЭяНЖХНКНЦХЪяОНПРяРЮМДЮПРХГЮЖХЪяРПНХРЕКЭЯРБНрЕУМНКНЦХХрНПЦНБКЪрСПХГЛтХГХЙЮтХГХНКНЦХЪтХКНЯНТХЪтХМЮМЯШуХЛХЪуНГЪИЯРБНжЕММННАПЮГНБЮМХЕвЕПВЕМХЕщЙНКНЦХЪщЙНМНЛЕРПХЙЮщЙНМНЛХЙЮщКЕЙРПНМХЙЮчПХЯОСМДЕМЙЖХЪ
открытое и закрытое состояния
Хотя для простоты мы часто представляем белковые молекулы как статические структуры, они таковыми вовсе не являются. Из-за своей тепловой энергии все большие молекулы внутренне нестабильны. При комнатной температуре химические связи растягиваются и ослабляются, то есть постоянно колеблются по отношению к устойчивому состоянию. Несмотря на то, что эти индивидуальные движения составляют величину только около 10–12 м (с частотой, достигающей 1013 Гц), такие атомные колебания могут приводить в итоге к гораздо более значительным и более медленным изменениям в структуре молекул. Это происходит потому, что многочисленные быстрые движения атомов периодически создают условия для взаимодействия функциональных групп белка, несмотря на наличие взаимных отталкивающих сил. Взаимодействия функциональных групп приводят к кинетическим переходам белка, которые, раз возникнув, могут длиться многие миллисекунды или даже секунды. Известным примером может служить молекула гемоглобина. Центры связывания кислорода заключены внутри макромолекулы этого белка,
Глава 2. Ионные каналы и нейрональная сигнализация 37
и к ним нет постоянного свободного доступа. Связывание кислорода может быть достигнуто только за счет транзиторного доступа молекул газа к центрам связывания на молекуле тема. Таким образом, молекула гемоглобина «дышит», периодически становясь доступной для связывания кислорода, иначе данный белок был бы не способен выполнять предназначенную функцию по переносу газов 1).
Для ионных каналов функционально важными являются переходы между открытым и закрытым состояниями. Эти переходы совершаются практически моментально. С другой стороны, при системном изучении поведения любого ионного канала мы обнаружим, что время открытого состояния варьирует случайным образом. Иногда канал открыт только одну миллисекунду или даже меньше, хотя в следующий раз он может быть открыт на гораздо более продолжительное время (рис. 2.4). Тем не менее, каждый канал имеет характерное среднее время открытого состояния (т), и все вариации происходят вокруг этого среднего показателя.
Некоторые ионные каналы открываются достаточно часто даже в покое. Иными словами, вероятность нахождения таких каналов в открытом состоянии в неактивированной клетке относительно высока. Большинство таких ионных каналов проницаемо для калия или хлора. Они важны для генерации мембранного потенциала покоя. Остальные ионные каналы при этом закрыты, то есть вероятность нахождения их в открытом состоянии очень низка. Активация этих каналов адекватным стимулом резко увеличивает вероятность открытия. Этот же стимул может деактивировать ионные каналы, бывшие активными в покое. Важно помнить, что активация или деактивация канала означает возрастание или снижение вероятности открытия канала, но не увеличение или уменьшение времени открытого состояния (т) канала.
Помимо активации и деактивации, ионный ток через каналы регулируется двумя другими факторами. Первый фактор заключается в том, что ионный канал переходит в новое конформационное состояние, в котором обычный активирующий стимул не способен вызвать открытие канала. Для ионных каналов, активируемых деполяризацией, такое состояние называется инактивацией. Для каналов, отвечающих на химические стимулы, это состояние известно как десенситнзация. Второй механизм — блок открытого канала. Такое случается, когда, например, крупная молекула (такая как токсин) связывается с ионным каналом и физически закупоривает пору. Другим примером может служить блокирование некоторых катионных каналов ионами магния. В этом случае ионы магния сами не проникают через ионный канал, но связываются с каналом в области его устья и тем самым мешают проникновению других катионов.
способы активации
Рис. 2.2 суммирует представления о способах активации ионных каналов. Некоторые каналы специфически отвечают на физические изменения в клеточной мембране нейрона. Наиболее яркими представителями этой группы являются потенциал-активируемые каналы. Примером может служить чувствительный к потенциалу натриевый канал, который отвечает за регенеративную деполяризацию, лежащую в основе генерации потенциала действия (глава 6). К этой группе относятся также механочувствительные ионные каналы, которые отвечают на механическое воздействие на клеточную мембрану. Рецепторы растяжения, содержащие ионные каналы такого рода, найдены в механорецепторах кожи (глава 17).
Другие ионные каналы открываются тогда, когда химические агенты активируют связывающие центры на молекуле канала. Такие лнганд-актнвнруемые ионные каналы подразделяются на две подгруппы, в зависимости от того, являются ли активные центры внутриклеточными или внеклеточными. Каналом, отвечающим на внеклеточную активацию, является катионный канал постсинаптической мембраны в скелетной мышце. Этот канал активируется нейротрансмиттером ацетилхолином, освобождающимся из двигательного нервного окончания (глава 9). Открытие ацетилхолин-активируемого ионного канала позволяет ионам натрия войти в клетку, вызывая деполяризацию мышечного волокна.
Лиганд-активируемые каналы, отвечающие на внутриклеточные стимулы, включают каналы, чувствительные к местным изменениям концентрации специфических ионов. Например, кальций-активируемые калиевые каналы активируются локальным повышением концентрации внутриклеточного кальция. Такие каналы играют важную роль в реполяризации клеточной мембраны во время завершения потенциала действия. Помимо ионов кальция, типичными представителями лигандов, активирующих ионные каналы с ци-
38 Раздел П. Передача информации в нервной системе
| Рис. 2.2. Способы активации ионных каналов. (А) Ионные каналы, активируемые изменением мембранного потенциала или растяжением мембраны. (В) Ионные каналы, активируемые химическими агентами, либо с внеклеточной, либо с внутриклеточной стороны. |
Fig. 2.2. Modes of Channel Activation. The probability of channel opening is influenced by a variety of stimuli. (A) Some channels respond to changes in the physical state of the membrane, specifically changes in membrane potential (voltage-activated) and mechanical distortion (stretch-activated). (B) Ligand activated channels respond to chemical agonists, which attach to binding sites on the channel protein. Neurotransmitters, such as glycine and acetylcholine, act on extracellular binding sites. Included among a wide variety of intracellular ligands are calcium ions, subunits of G proteins, and cyclic nucleotides.
топлазматической стороны мембраны, являются циклические нуклеотиды. Циклический ГМФ, например, отвечает за активацию натриевых каналов в палочках сетчатки. Такой тип канала играет принципиальную роль в работе зрительного анализатора (глава 19).
Эта классификация не является достаточно строгой. Например, кальций-активируемые калиевые каналы чувствительны также к изменению потенциала, а некоторые потенциал-активируемые ионные каналы чувствительны к внутриклеточным лигандам.
§ 2. Измерение токов одиночного канала
пэтч-кламп метод
Для измерения ионных токов через одиночные каналы первоначально был предложен непрямой метод анализа мембранного шума 2· 3). Затем был разработан способ прямой регистрации одиночных ионных каналов с помощью метода, который называется пэтч-кламп (patch-clamp 4· 5)). В совокупности эти подходы дали прямые ответы на вопросы, касающиеся функции ионных каналов, как то: какой заряд проходит через одиночный канал? как долго канал остается открытым? как время нахождения ионного канала в открытом или закрытом состоянии зависит от мембранного потенциала?
Пэтч-кламп метод, предложенный Э. Неером, Б. Сакманном и их коллегами, значительно углубил наши знания о функционировании ионных каналов. Для пэтч-кламп регистрации необходимо, чтобы кончик стеклянной пипетки с внутренним диаметром около 1 мкм плотно контактировал с мембраной исследуемой клетки. При удачном подведении, благодаря легкому присасыванию, между клеточной мембраной и стеклом пипетки (рис. 2.3А—В) создается сопротивление больше 109 Ом (отсюда возник термин «гигаомный контакт», gigaohm seal). Когда пипетка соединена с соответствующим усилителем, можно зарегистрировать небольшие токи, проходя-щие через участок мембраны, находящейся внутри кончика пипетки (рис. 2.3F). Такая конфигурация пэтч-кламп метода называется cell attached (контакт с клеткой). Высокоомный контакт гарантирует, что ионные токи, проводимые этим участком клеточной мембраны, проходят преимущественно через
Глава 2. Ионные каналы υ нейрональная сигнализация 39
| Рис. 2.3. Регистрация ионных токов методом пэтч-кламп. Электрод образует плотный контакт с мембраной (А), который благодаря легкому понижению давления превращается в гигаомный контакт (В). Оттягивание мембраны с последующим отрывом ее фрагмента приводит к конфигурации inside-out (С). Другой вариант основан на последовательном образовании конфигурации whole cell, и затем — outside-out (E). Fig. 2.3. Patch Clamp Recording. (A-E) Patch configurations, represented schematically. The electrode forms a seal on contact with the cell membrane (A), which is converted to a gi-gaohm seal by gentle suction (B) Records may then be made from the patch of membrane within the electrode tip (cell-attached patch). Pulling away from the cell results in the formation of a cell-free vesicle, whose outer membrane can then be ruptured to form an inside-out patch (C). Alternatively, the membrane within the electrode tip may be ruptured by further suction to obtain a whole-cell recording (D) or, by pulling, to obtain an outside-out patch (E). (F) Recording arrangement. The patch electrode is connected to an amplifier that converts channel currents to voltage signals. The signals are then displayed on an oscilloscope trace or computer screen so that amplitudes and durations of single-channel currents can be measured. (A-E after Hamill et al., 1981.) | 
|
усилительную аппаратуру, а не теряются в месте контакта пэтч-пипетки с клеткой. При использовании пэтч-кламп метода регистрируемые события состоят из прямоугольных токовых сигналов, отражающих процессы открытия и закрытия одиночных ионных каналов. Таким образом, мы в реальном времени можем наблюдать активность одиночных белковых молекул мембраны.
В простом случае токи одиночных каналов появляются нерегулярно и с различной продолжительностью, но с постоянной амплитудой (рис. 2.4А). В некоторых случаях, однако, картина токов может быть более сложной. Некоторые ионные каналы, например, в открытом состоянии могут иметь более чем один уровень проводимости, как это показано на рис. 2.4В. Кроме того, ионные каналы могут проявлять комплексную кинетику. Например, ток через одиночный ионный канал может выглядеть не как простой прямоугольник, а как «вспышка» открытий канала (рис.2.4С).
Таким образом, пэтч-кламп метод предоставляет новые уникальные возможности для изучения поведения ионных каналов. Во-первых, изоляция маленького участка мембраны позволяет наблюдать активность всего нескольких ионных каналов, а не тысяч, которые активируются в целой клетке. Во-вторых, высокое сопротивление контакта дает возможность регистрировать даже крайне
40 Раздел П. Передача информации в нервной системе
|
| Рис. 2.4. Примеры одиночных ионных каналов, зарегистрированных методом пэтч-кламл. Fig. 2.4. Examples of Patch Clamp Recordings. (A) Glutamate-activated channel currents recorded in a cell-attached patch from locust muscle occur irregularly, with a single amplitude and varied open times. Downward deflections indicate current flowing into the cell. (B) Acetylcholine-activated currents from single channels in an outside-out patch from cultured embryonic rat muscle reach a maximum amplitude of about 3 pA and relax to a substate current of about 1,5 pA. Downward deflections indicate inward current. (C) Pulses of outward current through glycine activated chloride channels in an outside-out patch from cultured chick spinal cord cells are interrupted by fast closing and reopening transitions to produce bursts. (A after Cull-Candy, Miledi, and Parker, 1980; В after Hamill and Sakmann, 1981; С from A. I. McNiven and A. R. Martin, unpublished.) |
малые токи. В результате мы имеем возможность точного измерения амплитуд токов одиночных ионных каналов и можем провести анализ кинетики каналов.
оНХЯЙ ОН ЯЮИРС: