 |
юБРНюБРНЛЮРХГЮЖХЪюПУХРЕЙРСПЮюЯРПНМНЛХЪюСДХРаХНКНЦХЪаСУЦЮКРЕПХЪбНЕММНЕ ДЕКНцЕМЕРХЙЮцЕНЦПЮТХЪцЕНКНЦХЪцНЯСДЮПЯРБНдНЛдПСЦНЕфСПМЮКХЯРХЙЮ Х ялххГНАПЕРЮРЕКЭЯРБНхМНЯРПЮММШЕ ЪГШЙХхМТНПЛЮРХЙЮхЯЙСЯЯРБНхЯРНПХЪйНЛОЭЧРЕПШйСКХМЮПХЪйСКЭРСПЮкЕЙЯХЙНКНЦХЪкХРЕПЮРСПЮкНЦХЙЮлЮПЙЕРХМЦлЮРЕЛЮРХЙЮлЮЬХМНЯРПНЕМХЕлЕДХЖХМЮлЕМЕДФЛЕМРлЕРЮККШ Х яБЮПЙЮлЕУЮМХЙЮлСГШЙЮмЮЯЕКЕМХЕнАПЮГНБЮМХЕнУПЮМЮ АЕГНОЮЯМНЯРХ ФХГМХнУПЮМЮ рПСДЮоЕДЮЦНЦХЙЮоНКХРХЙЮоПЮБНоПХАНПНЯРПНЕМХЕоПНЦПЮЛЛХПНБЮМХЕоПНХГБНДЯРБНоПНЛШЬКЕММНЯРЭоЯХУНКНЦХЪпЮДХНпЕЦХКХЪяБЪГЭяНЖХНКНЦХЪяОНПРяРЮМДЮПРХГЮЖХЪяРПНХРЕКЭЯРБНрЕУМНКНЦХХрНПЦНБКЪрСПХГЛтХГХЙЮтХГХНКНЦХЪтХКНЯНТХЪтХМЮМЯШуХЛХЪуНГЪИЯРБНжЕММННАПЮГНБЮМХЕвЕПВЕМХЕщЙНКНЦХЪщЙНМНЛЕРПХЙЮщЙНМНЛХЙЮщКЕЙРПНМХЙЮчПХЯОСМДЕМЙЖХЪ
морфологическое свидетельство в пользу экзоцитоза
Хеузер и Рииз68) изобрели новый методический прием, который позволил им быстро замораживать мышцу лягушки в течение нескольких миллисекунд после одиночной стимуляции двигательного нерва с последующим исследованием с помощью методики замораживания-скалывания. В результате стало возможным получить сканирующие электронные микрографии везикул, запечатленных в момент слияния с пресинаптической мембраной, а также с определенной долей точности определить временной ход процесса слияния.
Глава 11. Высвобождение медиатора 231
|
| Рис. 11.16. Распределение кальциевых каналов в нервно-мышечном соединении. Нервно-мышечное соединение лягушки окрашено двумя метками: a-бунгаротоксином (В) и антителами к кальциевым каналам (А); фотографии получены с помощью конфокального лазерного микроскопа. Изображения кальциевых каналов (А), рецепторов АХ (В) и наложение зтих изображений (С). Расположение кальциевых каналов совпадает с активными зонами в нервном окончании, сконцентрированными в виде узких полосок напротив постсинаптических складок, которые видны по расположению АХ рецепторов (отмечены стрелками). Fig. 11.16. Distribution of Calcium Channels at the neuromuscular junction. Mouse neuromuscular junctions double--labeled with a-bungarotoxin (B) and with antibodies to calcium channels (A) and observed by confocal laser microscopy. Images of calcium channels (A), ACh receptors (B), and superimposed images (C). The position of the calcium channels matches that of the active zones in the nerve terminal, concentrated in narrow bands that are in register with the openings of the junctional folds, as marked by ACh receptors (arrowheads). (After Sugiura et at 1995; micrographs courtesy of C.-P. Ko.) |
С этой целью мышца крепится к нижней поверхности падающего поршня, причем двигательный нерв прикреплен к стимулирующим электродам. В процессе падения поршня запускается стимулятор, который раздражает нерв с заданным временным промежутком до того, как мышца придет в соприкосновение с медным основанием, охлажденное жидким гелием до 4 К. Важной особенностью этого эксперимента является то, что длительность пресинаптического потенциала действия продляется 4-аминопиридином (4-АП), добавляемым в наружный раствор. 4-АП значительно увеличивает количество и длительность квантового высвобождения, вызванного одиночным стимулом, и, соответственно, количество открытий везикул, которые можно увидеть с помощью электронного микроскопа (рис. 11.17А и В).
На основании этих экспериментов было сделано два важных вывода: во-первых, наибольшее количество открываемых везикул наблюдалось в том случае, если замораживание осуществлялось через 3-5 мс после стимуляции. Это соответствует пику постсинаптического тока, регистрируемого в обработанных кураре и 4-АП мышцах. Другими словами, максимальное количество открываний везикул по времени совпадало с пиком постсинаптического физиологического ответа. Во-вторых, количество открываний везикул увеличивалось при повышении концентрации 4-АП, и это увеличение было прямо пропорционально увеличивающемуся под действием 4-АП квантовому составу потенциалов концевой пластинки, который был рассчитан по данным электрофизиологических экспериментов (рис. 11.17С). Таким образом, количество открываний везикул коррелирует с количеством и временным ходом квантового высвобождения. В последующих экспериментах Хеузер и Рииз69) дали более детальное описание временного хода открывания везикул и показали, что количество открываний увеличивается в течение периода от 3 до 6 мс после стимуляции, а затем уменьшается в течение последующих 40 мс.
Экзоцитоз был также исследован на живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии. В этих экспериментах пептидсодержашие везикулы были помечены флуоресцентной меткой в культивируемых клетках линии PC 12, и хромаффинные гранулы—в адреномедуллярных клетках. Высвобождение катехоламинов измерялось с помощью амперометрии — метода с очень высокой чувствительностью, в котором микроэлектрод, сделанный из угольного волокна, используется для детекции медиаторов по току, возникающему при их окислении. С
232 Раздел II. Передача информации в нервной системе
 
|
| Рис. 11.17. Экзоцитоз везикул соответствует квантовому высвобождению. (А) Электронная микрофотография цитоплазматической половины пресинаптической мембраны в нервном окончании лягушки (вид со стороны си наптическои щели); получено с помощью техники замораживания-скалывания. Область активной зоны имеет вид невысокого гребня, вдоль которого располагаются частицы (около 10 нм в диаметре). (В) Вид нервного окончания такой же, как на А, но полученный после заморозки в тот момент, когда нерв начал выделять большое количество квантов (5 мс после стимула). «Дыры» на мембране (одна из них отмечена квадратом) являются местами слияния везикул; широкие вмятины соответствуют везикулам, которые слились с пресинаптической мембраной после зкзоцитоза (отмечены звездочками и стрелками). (С) Сравнение количества открываний везикул (подсчитанного по изображениям, полученным с помощью замораживания-скалывания) и количества высвобожденных квантов (определенного в электрофизиологическом эксперименте). Диагональная линия является теоретической зависимостью 1: 1, которая предполагает, что одна открывшаяся везикула высвобождает 1 квант медиатора. Количество высвобождаемого медиатора изменялось путем добавления 4-АП в различных концентрациях (стрелкой обозначен контроль). Fig. 11.17. Vesicle Exocytosis Corresponds to Quantal Release. (A) Freeze-frarture electron micrograph of the cytoplasmic half of the presynaptic membrane in a frog nerve terminal (as if observed from the synaptic cleft). The region of the active zone appears as a slight ridge delineated by membrane particles (about 10 nm in diameter). (B) Similar view of a terminal that was frozen just at the time the nerve began to discharge large numbers of quanta (5 ms after stimulation). "Holes" (box) are sites of vesicle fusion; shallow depressions mark where vesicles have collapsed flat after opening. (C) Comparison of the number of vesicle openings (counted in freeze-fracture images) and the number of quanta released (determined from electrophysiological recordings). The diagonal line is the 1: 1 relationship expected if each vesicle that opened released 1 quantum of transmitter. Transmitter release was varied by adding different concentrations of 4-AP (arrow indicates control, without 4-AP). (From Heuser et al., 1979; micrographs kindly provided by J. E. Heuser.) |
помощью флуоресцентного микроскопа можно было наблюдать, как везикулы скапливаются у плазматической мембраны и исчезают по мере того, как их флуоресцентное содержимое высвобождается в результате экзоцитоза (рис. 11.18)70· 71). Исчезновение каждой из везикул сопровождалось высвобождением кванта медиатора, регистрируемого с помощью амперометрии. Оптические флуоресцентные методы были также использованы для исследования движения везикул внутри клеток, описания того, каким образом они подходят к плазматической мембране и скапливаются около нее перед слиянием72· 73).
Таким образом, на сегодняшний день накоплены веские доказательства в пользу того, что синаптические везикулы являются морфологическим субстратом кванта медиатора и что каждая везикула содержит несколько тысяч молекул медиатора. Содержимое везикул может высвобождаться путем экзоцитоза спонтанно, с низкой частотой высвобождения (вызывая миниатюрные синаптические потенциалы), а также в ответ на пресинаптическую деполяризацию. Существует и иная точка зрения74), однако другие механизмы, предложенные для объяснения квантового высвобождения, например, кальций-активируемые
Глава 11. Высвобождение медиатора 233
| Рис. 11.18. Наблюдение за зкзоцитозом в живых клетках. (А) Хромаффинные клетки были выращены на покровных стеклах и окрашены флуоресцентной меткой, которая концентрируется в хромаффинных везикулах. Одиночные везикулы, расположенные возле плазматической мембраны, визуализируются с помощью флуоресцентного микроскопа. Высвобождение катехоламинов одновременно детектируется с помощью амперометрии. (В) Изображения одной хромаффинной везикулы, полученные с интервалом в 2 с после того, как клетка была простимулирована раствором с повышенной концентрацией калия Светящееся пятно в центре исчезает быстро и необратимо, как только везикула подвергается экзоцитозу и высвобождает свое флуоресцентное содержимое. (С) Временной ход зкзоцитоза в ответ на увеличение внеклеточной концентрации калия, зарегистрированного с помощью амперометрической детекции высвобождения катехоламинов, а также по исчезновению флуоресцентных пятен. Обратите внимание на то, что высвобождение и исчезновение пятен совпадают (стрелкой отмечен один из примеров). Большее количество событий регистрируется с помощью амперометрии, поскольку амперометрический электрод детектирует зкзоцитоз с большой поверхности клетки, в то время как измерение флюоресценции проводится лишь от небольшого участка клеточной поверхности. Fig. 11.18. Exocytosis Observed in Living Cells. (A) Chromaffin cells growing on a glass coverslip in cell· culture were labeled with a fluorescent dye, which becomes concentrated in chromaffin vesicles. Individual vesicles docked at the plasma membrane were visualized by evanescentwave microscopy. At the same time, release of catecholamines was detected by amperometry (B) High-power images of a single chromaffm vesicle at 2 s intervals after the cell was stimulated with high potassium. The spot disappears abruptly and permanently as the vesicle undergoes exocytosis and releases its fluorescent contents. (C) The time course of exocytosis in response to an increase in extracellular potassium concentration, as recorded by amperometric detection of catecholamine release and the disappearance of fluorescent spots. Note the coincidence of release and spot disappearance (the arrows mark one example). More events are | 
recorded by amperometry than by fluorescence because the amperometric electrode detects exocytosis over a large part of the cell, while only a small portion of the cell surface is imaged by evanescent-wave microscopy. (After Steyer, Horstmann, and Aimers, 1997; micrographs kindly provided by W. Aimers.)
|
квантовые ворота в пресинаптической мембране, не получили достаточной экспериментальной поддержки. Как было замечено выше, в некоторых специализированных синапсах сетчатки деполяризация может высвобождать медиатор посредством транспортных белков в пресинаптической мембране, т. е. посредством механизма, который не является квантовым, не опосредован экзоцитозом везикул и не зависит от входа кальция75· 76).
оНХЯЙ ОН ЯЮИРС: